小RNA是調控基因表達和分化的關鍵分子。然而，許多不同種類的小RNA (sRNAs)具有不同的生物發生途徑，因此可能具有不同的生化特性。為了通過深度測序分析sRNAs，互補DNA合成需要對RNA分子本身進行操作。因此，由於生化標準的存在，建文庫過程中的酶活性會對文庫的內容產生偏差。

        我們比較了四種不同的RNA製備文庫操作：(a)基於連接的方法僅允許5'-單磷酸化RNA進入文庫，(b)基於連接的方法允許額外的5'-三磷酸和Cap結構，(c)基於連接的，基於模板轉換的文庫製備，和(d)基於模板轉換的庫製備，使3'-磷酸化的RNA進入文庫。

        我們的數據顯示，依賴連接和依賴連接的文庫在它們對單個sRNA類(如microRNA(miRNA)，Piwi相互作用RNA(piRNA)和轉移RNA片段)的偏好方麵存在很大差異。此外，兩種方法的miRNA組成不同，經過焦磷酸酶處理後可以識別出更多的microRNA亞型(isomiRs)。piRNAs在模板轉換庫中得到了豐富，這一過程顯然包含了更多不同種類的RNA。

        我們的數據表明，兩種方法的miRNA組學幾乎沒有可比性。基於連接的文庫豐富了典型miRNA，可能是適合miRNA組學研究的方法。模板轉換庫包含數量增加的片段和長RNAs的不同組成。連接無關的文庫似乎顯示了一個更真實的sRNA表達譜，對生化修飾的偏倚更低。