目的

分析本院兒科假絲酵母菌血流感染的臨床分布、菌種分布和耐藥性，為臨床有效預防和治療提供參考依據。

方法

收集2009年1月至2015年12月兒科住院患者的血液標本，經BacT/ALERT 3D全自動血培養儀培養，沙保羅培養基分離培養，柯瑪嘉顯色培養基，API 20CAUX酵母樣真菌鑒定板和VITEK-2 compact YST卡進行菌種鑒定，藥敏試驗采用ATB FUNGUS 3微量稀釋板，總結並分析患兒的臨床資料。

結果

分離出的176株假絲酵母菌中，來自新生兒92株(52.3%)，來自PICU 46株(26.1%)。新生兒組中早產兒85株，其中低和極低出生體重兒37株、新生兒肺炎20株、新生兒呼吸窘迫綜合征9株;PICU以重症感染患兒為主，年齡2 d～13歲，平均11個月。176株假絲酵母菌中，白假絲酵母菌71株(40.3%)，近平滑假絲酵母菌62株(35.2%)，光滑假絲酵母菌16株(9.1%)，熱帶假絲酵母菌9株(5.1%)，其他假絲酵母菌18株(10.2%)。

結論

假絲酵母菌血流感染可發生於各年齡段，以早產兒和PICU重症感染患兒為主;菌種以白假絲酵母菌為主，近平滑假絲酵母菌次之，除光滑假絲酵母菌外，其他菌種對氟康唑等常用抗真菌藥物敏感率>93%，臨床上選擇抗真菌治療時要考慮假絲酵母菌的菌種類別。

近年來隨著廣譜抗菌藥物、免疫抑製劑和糖皮質激素在臨床的大量應用，以及人工呼吸機、留置導管等各種侵入性診療技術的增多，使得侵襲性真菌感染逐年上升，臨床上血液真菌感染日趨常見[1]，已引起廣泛關注。在新生兒時期，侵襲性真菌感染因缺少特異性的臨床表現，因此可能因延誤診斷而錯過治療的最佳時機，從而導致患兒嚴重的並發症甚至死亡[2]。PICU患兒多為重症感染或基礎疾病嚴重，導致機體免疫力低下，使其成為高危易感人群，有些患兒病情進展迅速，病死率高。研究顯示，危重患兒念珠菌感染的病死率高達48.9%[3]。為了解我院兒童患者血液假絲酵母菌感染的臨床分布、菌種分布及常用抗真菌藥物敏感性特點，對本院2009年1月至2015年12月7年間從兒科血培養標本中分離出的176株假絲酵母菌進行分析，為臨床抗真菌治療提供合理依據。

1　對象與方法

1.1　研究對象

收集2009年1月至2015年12月我院臨床兒科送檢的門診和住院患者的血培養標本，分離出176株假絲酵母菌，分析患兒的科室、年齡、疾病類型和菌種分布。

1.2　主要儀器與試劑

1.2.1　儀器

BacT/ALERT 3D全自動血培養儀和VITEK-2 compact 全自動細菌鑒定分析儀，購自法國生物梅裏埃公司。

1.2.2　分離鑒定培養基

沙保羅瓊脂培養基，科瑪嘉顯色培養基，API20CAUX酵母樣真菌鑒定板，YST酵母菌鑒定卡均購自法國生物梅裏埃公司。

1.2.3　藥敏培養基

ATB FUNGUS 3真菌藥敏微量稀釋板購自法國生物梅裏埃公司。

1.2.4　抗真菌藥物

氟康唑，兩性黴素B，5-氟胞嘧啶，伊曲康唑，伏立康唑。

1.3　質控菌株

近平滑假絲酵母菌ATCC22019，白假絲酵母菌

1.4　方法

1.4.1　分離培養

臨床送檢的血細菌培養、血真菌培養瓶陽性標本報警後，記錄陽性報警時間並直接膜塗片，行革蘭染色鏡檢觀察到真菌孢子或菌絲後，接種到沙保羅瓊脂和科瑪嘉念珠菌顯色培養基，(35±1) ℃孵箱中24～48 h。

1.4.2　菌種鑒定

科瑪嘉念珠菌顯色培養基生長翠綠色為白假絲酵母菌，藍色為熱帶假絲酵母菌，紫色為光滑假絲酵母菌，粉紅色、邊緣模糊且有絨毛為克柔假絲酵母菌，無色或顏色不明顯用API20CAUX酵母樣真菌鑒定板或VITEK YST酵母菌鑒定卡鑒定到種。

1.4.3　藥敏試驗

采用ATB FUNGUS 3真菌藥敏微量稀釋板檢測5種抗真菌藥物的最小抑菌濃度。藥敏結果依據美國CLSI標準判讀。

1.5　統計學方法

采用WHONET 5.6軟件進行統計分析。

2　結果

2.1　菌株分布

7年間兒科共送檢血液標本62 356份，共分離出176株假絲酵母菌，其中白假絲酵母菌71株(40.3%)，近平滑假絲酵母菌62株(35.2%)，光滑假絲酵母菌16株(9.1%)，熱帶假絲酵母菌9株(5.1%)，其他假絲酵母菌18株(10.2%)(分別為克柔假絲酵母菌5株，新生隱球菌4株，無名假絲酵母菌2株，黑馬朗假絲酵母菌2株，高裏假絲酵母菌2株，阿薩絲孢酵母1株，釀酒假絲酵母菌1株，解脂假絲酵母菌1株)。

2.2　血培養陽性報警時間

176株假絲酵母菌陽性報警時間為(36.17±19.69) h;白假絲酵母菌陽性報警時間為(34.15±20.88) h，最短15.21 h，最長84 h;近平滑假絲酵母菌陽性報警時間為(40.28±20.24) h，最短18.96 h，最長127.6 h。

2.3　臨床分布

2.3.1　科室分布

176株假絲酵母菌分離自新生兒內科92株(52.3%)，PICU 46株(26.1%)，新生兒外科15株(8.5%)，其他兒科科室23株，包括兒科呼吸病房5株，兒科血液病房5株，兒科普通外科病房4株，兒科神經病房4株，兒科腎內病房2株，兒科消化病房2株，兒科心內病房1株。

2.3.2　年齡

範圍 2 d～13歲，新生兒64株(36.4%)，年齡2～29 d，平均年齡19 d;其中<1歲61株(34.6%)，年齡範圍1～11個月，平均年齡3.5個月;>1歲51株(29.0%)，年齡範圍1～13歲，平均年齡5.5歲。

2.3.3　疾病種類分布

新生兒內科92株，早產兒85株(92.4%);早產兒中低出生體重兒7株(8.2%)、極低出生體重兒30株(35.3%)，新生兒肺炎20株(23.5%)、新生兒呼吸窘迫綜合征9株(10.6%)。92例新生兒病例均行機械通氣治療，均行深靜脈置管，均在真菌感染前使用過2種以上廣譜抗生素，包括注射用頭孢他啶，注射用頭孢呱酮鈉舒巴坦鈉，泰能，美平，萬古黴素。新生兒外科15株，包括食管閉鎖術後，先天性巨結腸術後，先天性隔疝術後，小腸造瘺術後等;PICU 46株，包括重症膿毒症16株(34.8%)，外傷6株(13.1%)，及糖尿病、血液病等。

2.4　分離株的時間分布

2009年1月至2015年12月兒科血培養假絲酵母菌分離株數及構成比見表1。白假絲酵母菌分離率最高(40.3%)，近平滑假絲酵母菌次之(35.2%)。

2.5　藥敏試驗

白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌對5種常用抗真菌藥物的敏感性見表2，其他假絲酵母菌未列入表中。

3　討論

近年來由於大量廣譜抗生素、免疫抑製劑在臨床的廣泛使用，導致菌群失調和二重感染，使得真菌血流感染的發生率逐年增多，真菌的耐藥率也呈上升趨勢，真菌的耐藥性已引起人們的廣泛關注[4]。導致兒童真菌性膿毒症的高危因素較多，目前國內外報道主要包括早產、低出生體重、長期廣譜抗生素應用、中心靜脈置管、機械通氣、長期靜脈營養、外科手術、入住ICU時間等[5,6,7,8]。

本組研究表明，兒童假絲酵母菌血流感染總體仍以白假絲酵母菌為主(40.3%)，但以近平滑假絲酵母菌為代表的非白假絲酵母菌類的比例逐漸增加，近平滑假絲酵母菌分離率高達35.2%，光滑假絲酵母菌為9.1%，熱帶假絲酵母菌為5.1%。研究表明，光滑假絲酵母菌多發生在使用廣譜抗生素時，尤其是第三代頭孢菌素、萬古黴素和靜脈營養的患兒[6]。文獻報道，近平滑假絲酵母菌的感染常與導管相關，導管技術的應用是血液真菌感染易感因素之一[7,8]。這是由於一方麵念珠菌黏附能力強，極易在中心靜脈導管表麵定植，通過導管輸入的高營養液又進一步促進其生長，因此，臨床在懷疑患兒中心靜脈導管相關性真菌感染時，應將導管及時拔出或更換;另一方麵，近平滑假絲酵母菌多存在於機體的皮膚表麵，可通過醫療行為由醫護人員的手部傳遞給免疫力低下的患兒，因此，加強醫護人員的手衛生，可有效控製醫院獲得性近平滑假絲酵母菌感染。

血液中檢出真菌是診斷患者血液真菌感染的有力證據，即血培養是診斷真菌血症的"金標準"，快速鑒定真菌並進行藥物敏感試驗，對患者的抗感染治療至關重要。念珠菌感染血培養陽性率為40%～60%，是新生兒念珠菌感染的主要診斷方法[9]。而事實上，由於真菌在血液中存在一過性和難培養的特性，以及臨床標本送檢的滯後性等原因，常導致血液真菌培養的陽性率偏低。此外，由於新生兒血培養采血量較少，也是引起假陰性的原因。由於真菌對糖代謝能力較弱，CO2產生量少，且酵母樣真菌對營養條件有特殊要求，出現陽性報警時間較長。本組資料中，假絲酵母菌陽性總體報警時間為(36.17±19.69) h;白假絲酵母菌為(34.15±20.88) h，最長84 h;近平滑假絲酵母菌為(40.28±20.24) h，最長可達127.6 h，這與文獻報道[10]相同。由於真菌培養需要時間較長，因此臨床疑似真菌感染時，可適當延長培養時間以提高真菌檢出率。

本研究表明，真菌血流感染可發生在兒童的各個年齡段，但以新生兒科為主，占52.3%。新生兒真菌性膿毒症的高危因素較多，目前報道主要包括早產、低出生體重、長期廣譜抗生素應用、中心靜脈置管、機械通氣、長期靜脈營養、外科手術等[11,12,13]。本組資料中，早產兒85株占新生兒的92.4%，其中低和極低出生體重兒37株，占早產兒的43.5%，表明小胎齡、低出生體重的早產兒仍是真菌性膿毒症發生的主要群體;另外，本研究中早產兒合並新生兒肺炎20株(23.5%)、合並新生兒呼吸窘迫綜合征9株(10.6%)，這些患兒需要更多的有創操作及監護。本組92例新生兒均行機械通氣治療，均行深靜脈置管，均在真菌感染前使用過2種以上廣譜抗菌藥物治療，由於上述這些高危因素的存在，導致新生兒病房是真菌血流感染的高危病區，而早產兒及其中的低出生體重兒是真菌血流感染的高危對象。新生兒外科以先天性疾病術後為主，如食管閉鎖術後，先天性巨結腸術後，先天性隔疝術後，小腸造瘺術後等。本組176株假絲酵母菌分離自PICU 46株(26.1%)，且以重症膿毒症為主，這是由於PICU患兒一是住院時間長;二是患兒常帶有多種體腔和血管內插管，進行各種有創監測和治療，易造成皮膚和黏膜等解剖生理屏障損害，使得正常定植的條件致病真菌，以及環境中的真菌侵入血流而感染;三是長期使用廣譜抗生素和糖皮質激素為另一重要醫源性因素，這是因為在臨床治療原發病時，常將重點放在預防和治療細菌感染，療效不佳時就頻繁更換抗生素，使腸道內生態平衡破壞，真菌在腸道內大量生長繁殖，進而為侵入血流創造了條件，同時不恰當使用糖皮質激素，可使機體免疫力受到抑製，防禦係統遭到破壞，從而促進真菌生長[14]。

目前，兒童侵襲性真菌感染的治療藥物和成人一樣，主要包括兩性黴素B、三唑類(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑)、嘧啶類及棘白菌素類。兩性黴素B雖然耐藥性低，是首選的治療藥物之一，但因其具有一定的腎毒性，對處於生長發育期的兒科患者危害更大，從而限製了其臨床應用;氟康唑因半衰期較長，親脂性低，具有較好的滲透性，不良反應較少，可口服和靜脈使用，且價格相對低廉，是理想的治療和預防性藥物[15]，缺點是克柔念珠菌對其天然耐藥，光滑念珠菌呈劑量依賴性耐藥;伏立康唑相比氟康唑抗菌譜較廣，可用於氟康唑耐藥的克柔念珠菌、光滑念珠菌的治療，但其在新生兒應用中的療效和安全性均有待進一步研究;氟胞嘧啶由於其毒性較大，無口服劑型，單一使用容易耐藥，故不推薦應用於兒童尤其是新生兒。本組資料顯示，兩性黴素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和氟胞嘧啶對假絲酵母菌的整體敏感性均>93%，尤其氟康唑對分離率較高的白假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌敏感率>95%，所以臨床懷疑真菌感染的高危患兒，可使用氟康唑進行早期經驗性抗真菌治療，以減少真菌性膿毒症的發生。因本研究檢出5株氟康唑天然耐藥的克柔假絲酵母菌，16株劑量依懶性耐氟康唑的光滑假絲酵母菌，所以在實施預防用藥和早期經驗性治療時，如果臨床治療效果不佳，應考慮耐藥菌株感染的可能，及時調整治療方案。棘白菌素類為新型抗真菌藥物，通過抑製真菌細胞壁的1，3-β-D 葡聚糖的合成，破壞真菌細胞壁結構的完整性，從而打破細胞滲透壓的平衡，使真菌細胞溶解死亡，因其獨特的作用機製，廣譜的抗菌效果，無交叉耐藥性，以及較高的耐藥性，最新的真菌感染治療指南首選棘白菌素類藥物，目前臨床應用較廣的有卡泊芬淨、米卡芬淨和阿尼芬淨[16]。

由於本組真菌血流感染資料中以新生兒科的早產兒為主，鑒於新生兒真菌性膿毒症的臨床表現和其他細菌性膿毒症相似，無特異性，早產兒主要表現為頻繁呼吸暫停、反應差、拒乳、灌注差、喂養不耐受等。因真菌性膿毒症可累及多個髒器，若累及中樞，多預後不良。目前微生物培養仍是確診的金標準，但由於其用時較長，且存在假陰性可能，容易導致漏診而延誤治療。另外，早產兒真菌性膿毒症的治療周期長，難度大，故對其的預防已引起極大關注，預防的對策主要有三方麵[17,18]：一是針對普通感染的防控措施，如加強醫務人員手衛生，環境物品消毒和隔離等;二是針對侵襲性真菌感染多種高危因素的措施，盡早使用腸內營養，減少廣譜抗菌藥物(特別是頭孢菌素)和皮質激素的使用，對中心靜脈導管進行集束護理等;三是藥物預防。英美等發達國家NICU應用氟康唑預防性治療被作為標準化的臨床措施。Kaufmen等[19]研究發現，使用抗真菌藥物預防性治療，即針對住院後的早產兒靜脈給予氟康唑3 mg/kg，每3天1次維持2周，以後隔天1次維持2周，最後每天1次維持2周，能夠顯著降低患兒真菌定植和侵襲性感染的機會，同時聯合使用兩性黴素B，可以減少氟康唑的使用量和耐藥菌株的出現。

綜上所述，我院兒童血液假絲酵母菌感染可發生在各年齡段，總體上仍以白假絲酵母菌為主，但近年來以近平滑假絲酵母菌為主的非白假絲酵母菌感染呈顯著增長的趨勢，已成為導致我院血液假絲酵母菌感染的主要原因之一，這種假絲酵母菌的菌種變化趨勢應引起臨床關注。以氟康唑為代表的5種監測的抗真菌藥物對常見的幾種假絲酵母菌敏感性均較高。氟康唑仍可首選用於血液假絲酵母菌感染的經驗性用藥。對血液真菌性膿毒症患兒，單憑血液真菌培養臨床用藥可能會錯過最佳治療時機，因此對具備發生真菌感染高危因素的、結合臨床表現、體征、真菌寄殖證據，應根據年齡特點積極治療基礎疾病，對疑有繼發性真菌感染達到經驗性早期治療標準的，臨床醫生可早期預判及時治療，如可能為導管相關性感染，應及時拔出導管，根據藥敏試驗合理選擇抗真菌藥物，適時調整治療方案，做到早預防、早診斷、早治療。