骨質疏鬆是最常見的骨代謝疾病，其特征在於骨組織內炎症環境的形成，導致的破骨能力異常上升以及成骨能力下降。遺憾的是，現有的骨質疏鬆治療藥物仍存在促成骨能力有限，抗炎作用不理想和副作用顯著等缺點。黑磷(BP)納米片因其獨特的綜合物化性能(如高比表麵積及良好的生物相容性等)，在生物醫學領域受到廣泛關注。2020年，王小磊教授領銜的光健康團隊發現BP可以負載足量藥物靶向病變組織，並最後降解為磷酸根離子(PO43-)。PO43-是一種重要的成骨原料。然而，單純將BP遞送至骨組織內很難產生預想中的促成骨效果。主要原因在於，體內環境中缺乏促進BP分解的光照與氧氣，BP在體內環境中往往需要近紅外光照或搭載藥物來增強體係的局部治療效果。而骨質疏鬆作為一種全身骨骼係統的疾病，局部治療效果的增強難以獲得理想的結果。過氧化銅(CP)納米粒子是一類具有增強芬頓酶催化活性的金屬過氧化物，其可在酸性環境下分解並釋放出銅離子(Cu2+)與H2O2。Cu2+在酸性條件下又會發生類芬頓反應催化H2O2生成羥基自由基(·OH，一種ROS)。有研究表明，Cu2+在骨礦化和骨再生中表現出顯著的促進作用。而分解產生的副產物·OH具有高氧化性，因此CP常常被應用於抗腫瘤、抗菌以及汙水處理領域。然而，將CP應用於組織再生的報道還較為罕見。理論上，·OH可以加速BP的分解，促進磷酸鹽的產生，與BP發揮“負負得正”的促成骨作用。
受這種類芬頓反應啟發(圖1)，王小磊教授團隊與南昌大學第二附屬醫院程細高教授團隊將CP與BP結合(BP/CP, CuB)，形成了一個以·OH為中心的“催化體係”。該項工作以題為“Fenton-like Reaction Inspired “·OH Catalyzed” Osteogenic Process for the Treatment of Osteoporosis”的論文發表在醫用材料類TOP期刊Advanced Healthcare Materials上。這種通過材料副作用相互抵消的方法集抗炎、促成骨和藥物靶向於一體，為骨質疏鬆的治療提供了一種新思路。
CuBA的合成和表征
本研究根據文獻報道的方法製備出CP納米粒子與BP納米片，之後通過室溫攪拌方法製備出負載CP的BP納米粒子(CuB)。最後，通過表麵富集氨基基團的聚多巴胺(PDA)包覆CuB，再將被羧基基團修飾的聚丙烯酸-阿侖膦酸鈉(PAA-ALE)通過酰胺化反應錨定在PDA表麵，獲得具備骨靶向能力的自礦化BP/CP@ALE(CuBA)納米粒子(圖2)。在骨質疏鬆的炎症與微酸環境中，CP產生的Cu2+可對成骨細胞產生一定程度的促成骨作用，而·OH可以加速BP在體內無光環境下的降解;BP不僅可以作為成骨原料，還可以作為一種ROS清除劑，減輕骨質疏鬆的骨組織內的炎症水平，同時抵消CP潛在的ROS毒性，其產生的副產物也是磷酸根，可以進一步發揮“負負得正”的促成骨作用(圖3-5)。
CuBA的抗炎性能研究
骨組織內的炎症水平升高是骨質疏鬆的病因之一，而ROS是造成炎症的主要原因，清除ROS的能力也代表了材料的抗炎能力。為了探究CuBA納米粒子是否具有清除ROS的能力，本研究在體外進行了ABTS自由基清除實驗與·OH清除實驗，並在細胞內通過2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針評估了CuBA清除細胞內ROS的能力。結果證實了材料中的BP具有很強的ROS清除能力，也就是抗炎能力，而CuBA中的BP不僅能清除CP產生的ROS，也有能力清除細胞在LPS刺激下產生的ROS(圖3)。
CuBA的巨噬細胞調控作用
作為炎症過程中不可或缺的一環，巨噬細胞在維持體內炎症水平、抵抗異物入侵和組織修複中不可或缺。巨噬細胞作為一種具有可塑性和多能性的細胞群體，在微環境的影響或刺激下表現出明顯的功能差異。根據激活狀態和功能的不同，可分為以促炎細胞因子分泌為主的M1型和以抗炎細胞因子分泌為主的M2型。而巨噬細胞分泌的促炎和抗炎細胞因子在骨質疏鬆的發生和發展中起著關鍵作用。本研究選擇了RAW 264.7細胞來評估CuBA納米粒子對巨噬細胞的調節作用。結果顯示(圖4)，當實驗組加入含BP的材料後，M1表型標記(CD86)的表達顯著降低，M2表型標記(CD206)的表達相比於對照組有一定的提高。
CuBA的促成骨性能評估
除了抗炎作用外，骨質疏鬆的治療還與後續成骨能力的增強有關。於是本研究使用MC3T3細胞在體外評估了CuBA納米粒子的促成骨能力本研究首先使用含促炎因子的培養基與成骨誘導培養基配成了含促炎因子的成骨誘導培養基，並用該培養基進行後續實驗。本研究將MC3T3細胞與不同材料共同孵育7天後, qRT-PCR結果顯示使用單純培養基孵育的對照組中成骨相關基因(RUNX2,ALP,OPN,OCN)的表達相比與實驗組顯著降低，但實驗組中BP組與BA組的升高水平相似，而CuB組與CuBA組表現出更高的、幾乎相同的表達水平。本研究認為這是因為體外培養時細胞周圍難以避免存在氧氣與一定的光照，促進了BP的分解。而CuB組與CuBA組中出去氧氣與光照的影響外，CP的存在依然加速了BP的分解，並釋放出Cu2+進一步增強了材料的促成骨作用WB實驗結果、ALP染色結果與茜素紅染色結果也表現出相同的趨勢。上述結果表明(圖5)，相較於單純BP，CuBA納米粒子在體外對MC3T3細胞的成骨能力有顯著的促進作用。
CuBA對OVX小鼠模型的療效評估
為了驗證合成的材料在體內治療骨質疏鬆的能力，本研究使用文獻中報道的小鼠骨質疏鬆造模方法(OVX)。並在連續幹預4周後取出小鼠的第三腰椎(L3)與左側股骨通過micro-CT與組織學檢測進行治療效果的評估(圖6)。結果表明，與Sham組相比，OVX組，BP組,BA組與CuB組的小鼠骨量顯著下降，證明骨質疏鬆造模成功。而CuBA組的骨顯著高於其他組(除Sham組)，證實了本研究合成的CuBA納米粒子對於骨質疏鬆具有顯著的療效。
【小結】
本研究受CP與BP在酸性環境下的類芬頓反應啟發，設計了一種以·OH為中心的“負負得正”抗炎促成骨係統，並通過將BP和CP包覆在有ALE修飾的PDA中，製備了一種新型CuBA納米粒子用於治療骨質疏鬆。該體係通過將PAA-ALE與粒子表麵的PDA包膜進行酰胺化連接，使CuBA納米粒子具備了骨靶向能力，從而在體內獲得了更好的治療效果。到達骨質疏鬆的骨組織後，既解決了BP在體內促成骨作用不足的缺點，又解決了CP潛在的ROS毒性。CP分解出的Cu2+促進了成骨，而副產物·OH被用於催化BP的分解產生大量的成骨原料，進一步促進了成骨。剩餘的BP能夠清除骨質疏鬆骨組織內的ROS從而發揮抗炎作用，並通過調節巨噬細胞極化來進一步增強成骨作用。這種抗炎促骨策略為納米材料的設計和開發提供了見解，還可用於治療骨科疾病以及其他疾病，如類風濕疾病和牙周炎。
原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202304091
