染色體非整倍體是胎兒出生缺陷最常見病因之一，其中以21-三體綜合征、18-三體綜合征最為常見，占所有足月妊娠的0.2%~0.3%。對先天性遺傳病進行產前篩查和產前診斷是優生優育的重要保證。自1970年以來，針對上述胎兒染色體疾病的產前篩查和產前診斷已逐漸應用到臨床上，並在降低出生缺陷方麵得到了良好的效果。
從取材方法進行分類，產前檢查分為有創性和無創性兩種。有創性產前診斷是目前診斷胎兒染色體疾病的的金標準，主要是指通過絨毛活檢術、羊水穿刺術和臍靜脈穿刺術采集胎兒細胞或組織，進行細胞核型分析獲取胎兒染色體信息，有創檢測的準確率為98%~99%，但伴有0.5%~1.0%的流產風險，同時也會伴有羊水滲漏、宮內感染等風險。因此，有創產前診斷目前僅應用於篩查高風險、高齡妊娠或家庭中生育過遺傳病患兒等情況。傳統的無創性產前檢查主要有超聲檢查和孕婦血清學檢測等方法，使用這些方法進行檢測可避免對胎兒和孕婦造成的危害，但是其靈敏度及特異性有限。近20年來，基於超聲檢查和孕婦各種蛋白或激素的血清學篩查相結合的產前篩查發展迅速。產前母體血清學篩查的目標疾病是21、18-三體綜合征和神經管缺陷，當假陽性率控製在5%時，在早孕期、中孕期、早中孕期的檢出率分別為82%~87%、81%、94%~96%，這些方法的假陽性率較高，為後續有創性產前診斷帶來較大的臨床壓力與實驗室壓力。
常規產前篩查和有創性產前診斷方法的局限性促使研究者積極開發一種針對胎兒染色體非整倍體及其他染色體異常的、無創傷性的高精度檢測方法。1997年Lo等通過孕育男性胎兒的孕婦外周血血漿Y染色體PCR擴增的方法證明了孕婦外周血循環中存在胎兒遊離DNA (cell free fetal DNA，cffDNA)，開啟了基於cffDNA無創產前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)方法。其後，利用各種分子診斷技術對cffDNA的檢測已經在胎兒性別鑒定、Rh血型鑒定、X連鎖隱性遺傳病、先天性多囊腎檢測等方麵得到應用，但由於方法繁瑣、耗費時間長、精度低、費用較高等問題，一直難以推廣於臨床。
近年來，隨著以高通量、自動化為顯著特征的二代測序技術的發展，基於該技術的NIPT在臨床上迅速得以應用。今年，國家衛生計生委婦幼司發布了第一批高通量測序技術臨床應用試點單位，同時發布了《高通量基因測序產前篩查與診斷技術規範(試行)》。如何充分理解並合理規範應用NIPT，如何正確解讀技術規範，將NIPT作為常規產前篩查方法時有哪些注意事項，我國產前篩查和產前診斷體係中NIPT該如何正確定位等，本文將對這些問題進行深入探討。
1、母血中胎兒遊離DNA的特性
大量研究發現，cffDNA來源於凋亡的胎兒滋養層細胞，經過胎盤屏障時受母體免疫攻擊破裂或胎盤細胞凋亡進入母血，自然降解成DNA片段。絕大部分的cffDNA都是包裹在核小體外部，與胎兒遊離RNA(cell free fetal RNA，cffRNA)相比，其在外周血漿中的性質更加穩定。早期研究認為，cffDNA在早、晚孕期分別占孕婦外周血總DNA的3%、6%，不同孕婦間個體差異性較大，其中80%的片段長度<193bp，最早可從孕4周時檢出，且在7周時穩定存在，隨孕周延長而增加。最近研究發現，cffDNA在早、中、晚孕期時含量分別為9.7%、9.0%、20%，分娩後母體cffDNA快速降解，2h內快速消失，半衰期為16.3min，再次妊娠cffDNA的檢測不受上次妊娠影響。
孕婦外周血中cffDNA微量存在、非整倍體檢測過度依賴於特定基因位點等特點，嚴重限製了使用常規分子生物學方法檢測胎兒染色體非整倍體的技術可靠性和使用範圍，迫切需要一種快速、高精度、可自動化的方法。新一代高通量測序方法的出現，可輕易實現同時針對百萬以上單分子多拷貝PCR克隆陣列的檢測，該方法對遊離DNA的研究已經成功應用到無創產前檢測、癌症和器官移植標誌物研究等方麵。
2、基於高通量測序技術的NIPT
2008年Lo和Quake兩個小組開創性地使用第二代高通量測序技術，對孕婦外周血漿進行測序，成功檢測出21-三體綜合征(trisomy 21，T21)胎兒，後續研究表明該方法的敏感性僅受限於測序序列的數據量，其分析的原理是胎兒為T21時，胎兒的21號染色體2個拷貝數變成了3個拷貝數，從孕婦外周血遊離DNA中檢出的21號染色體來源的序列(包括T21胎兒和正常孕婦)占整個基因組的比例較胎兒為21號染色體2個拷貝數時升高。
大量的科研小組對該方法的臨床應用進行了驗證，並使得該方法逐漸成為新的無創檢測染色體非整倍體的方法。Chiu等研究753例篩查高風險孕婦，其中86例T21胎兒，結果表明，該方法針對T21胎兒有100%的檢測靈敏度和97.9%的特異度，緊接著Ehrich和Sehnert兩個小組通過類似的方法證明了該方法的高靈敏度和特異度。Bianchi等對532個樣本進行了分析，與其他研究不同的是，此研究對包括易位型三體、嵌合體及複雜變異在內的胎兒非整倍體進行檢測，發現13、18、21、X、Y五大染色體非整倍體的檢測靈敏度為78.6%~100%，特異度為99.8%~100%，並發現某個染色體為非整倍體時並不影響其他染色體整倍體狀態的分析。
針對18-三體綜合征(trisomy 18，T18)和13-三體綜合征(trisomy 13，T13)的檢測，Chen等研究小組使用改進後的算法分析發現T13、T18的靈敏度提高到98.9%和91.9%。Palomaki等後續研究亦使用類似方法，對T18和T13的檢出率分別為100.0%和91.7%，假陽性率分別為0.28%和0.97%;對283個染色體非整倍體異常樣本複合檢出率為98.9%，總的假陽性率僅0.5%。
近期，北京協和醫院完成的一項以低危為主的孕婦人群進行遊離胎兒DNA檢測的研究，有效樣本1 741例，準確檢出其中的15例染色體非整倍體樣本：8例T21，3例T18，1例T13，2例45X，和1例XXY，結果現在該技術對21、18、13號染色體非整倍體的檢測靈敏度100%，特異度99.94%，發現2例假陽性(1例T18和1例XXY)，假陽性率0.12%。此項研究更進一步驗證了NIPT未來在中等風險及低風險孕婦人群的應用。不謀而合的是，國外研究也表明NIPT在中等風險人群中也具有類似的靈敏度和特異度。這預示著隨著臨床數據的積累，未來NIPT可以覆蓋到中等風險孕婦人群。
3、基於高通量測序技術的NIPT的優勢及局限性
基於高通量測序的胎兒遊離DNA檢測技術作為針對胎兒染色體非整倍體產前篩查技術的優勢在於：(1)無創傷性，避免了有創性取材方式帶來的汙染、感染及胎兒流產風險。(2)對於目標疾病有高的檢出率和低的假陽性率。該技術對於21、18、13-三體綜合征等常見染色體非整倍體異常總體檢出率在99%以上，假陽性率在0.1%左右，大大優於目前產前血清學篩查的效率，可以有效降低部分需要介入性產前診斷的數量，從而解決產前診斷技術或人力不足的問題。(3)適用的孕周範圍較大，從孕9周以後至中孕期。(4)臨床所需信息少，流程較簡單，質量控製相對容易。該技術用於胎兒疾病風險計算所需要的相關臨床信息很少，臨床操作簡單易行。(5)技術的擴展性強，未來有望擴展到染色體部分單體、三體綜合征等全部因劑量改變導致的染色體病及其他遺傳性疾病的檢測上。
但該技術還存在多種局限，體現在：(1)篩查的目標疾病尚偏少，僅針對胎兒21、18和13-三體綜合征，縮小了後續產前診斷的疾病範圍。目前的產前血清學篩查實際上涵蓋了除21、18-三體綜合征以外的其他染色體異常，篩查疾病比預期要廣泛。(2)多胎、嵌合體及父母中存在染色體異常的病例均不適於采用該技術進行篩查。因正常與異常細胞係比例不定，深度測序技術檢測嵌合體存在難度。對於多胎而言也有類似情況，如多胎中的某一個胎兒患有21-三體綜合征而其他胎兒為正常，該技術的檢測靈敏度將降低。(3)孕婦近期接受過異體輸血、移植手術、細胞治療，孕婦體重超過100kg等將影響無創檢測結果的準確性。(4)檢測費用較昂貴。
4、國內外應用指南及專家觀點
目前國內外NIPT的臨床研究已廣泛開展，已經發表了一係列專業協會共識或關於NIPT的臨床應用指南。2012年美國婦產科醫師協會(ACOG)與美國母胎醫學會(SMFM)共同發表委員會指導意見，指出胎兒遊離DNA檢測可以作為非整倍體高危人群的一種初篩檢測，其應用指征為：(1)孕婦年齡≥35歲。(2)超聲結果顯示非整倍體高危。(3)生育過三體患兒。(4)早孕期、序貫篩查、整合篩查或四聯篩查高風險。(5)父母為羅伯遜易位攜帶者。麵對NIPT迅猛發展帶給臨床遺傳谘詢的種種問題，2013年美國國家遺傳谘詢師協會(The National Society of Genetic Counselors，NSGC)針對無創DNA產前檢測發表指南，NSGC認為：(1)NIPT當前隻能作為染色體非整倍體產前篩查-診斷體係的補充檢測，檢測陽性結果必須通過有創產前診斷確診。(2)因缺乏在中低風險人群中的臨床數據，NIPT暫時不能替代現有的產前篩查技術。(3)現有的NIPT隻能檢測21、18、13-三體綜合征，所以應在孕婦檢測之前說明這項檢測的檢測範圍和局限性。(4)需重視檢測前和檢測後的遺傳谘詢，並給出正確的谘詢意見。(5)如果超聲檢查異常、家族有染色體異常病史、複發性流產、高齡、篩查陽性等，無論NIPT結果如何，都應對其進行詳細的遺傳谘詢。
國家衛生計生委全國產前診斷技術專家組也於2012年就胎兒遊離DNA產前檢測技術進行了論證，指出遊離胎兒DNA檢測技術在目前發展階段的目標疾病應該明確在胎兒2l、18和13-三體綜合征，該檢測技術是一種“近似於產前診斷水平的”、“目標疾病指向精確的”的產前檢篩查新技術，應該與現行的產前篩查體係相結合，並準確把握臨床適用人群。
2015年1月15日，國家衛生計生委婦幼司發布了第一批高通量測序技術臨床應用試點單位，同時發布了《高通量基因測序產前篩查與診斷技術規範(試行)》，規定了高通量基因測序產前篩查在臨床上的適用範圍、臨床服務流程及臨床質量控製。規範指出，高通量基因測序技術在產前篩查與診斷領域適用的目標疾病為常見胎兒染色體非整倍體異常(即21、18、13-三體綜合征)，最佳檢測時間應當為12~26+6周。適用人群為：(1)血清學篩查、影像學檢查顯示為常見染色體非整倍體臨界風險(即 1/1000≤唐氏綜合征風險值<1/270，1/1000≤18-三體綜合征風險值<1/350)的孕婦。(2)有介入性產前診斷禁忌證者。(3)就診時，患者為孕20+6周以上，錯過血清學篩查最佳時間，或錯過常規產前診斷時機，但要求降低21、18、13-三體綜合征風險的孕婦。慎用人群是指篩查的檢出率下降，假陽性及假陰性率上升，或已符合介入性產前診斷的指征，知情後拒絕直接選擇介入性產前診斷的孕婦。包括：(1)產前篩查高風險，預產期年齡≥35歲，以及有其他直接產前診斷指征的孕婦。(2)孕周<12周的孕婦。(3)高體重(>100kg)孕婦。(4)通過體外受精-胚胎移植方式受孕的孕婦。(5)雙胎妊娠的孕婦。(5)合並惡性腫瘤的孕婦。不適用人群：(1)染色體異常胎兒分娩史，夫婦一方有明確染色體異常的孕婦。(2)孕婦1年內接受過異體輸血、移植手術、細胞治療或接受過免疫治療等對高通量基因測序產前篩查與診斷結果將造成幹擾的。(3)胎兒影像學檢查懷疑胎兒有微缺失微重複綜合征或其他染色體異常可能的。(4)各種基因病的高風險人群。同時規範還指出對未接受中孕期血清學篩查而直接進行高通量基因測序產前篩查與診斷的孕婦，應當在孕15~20+6周期間進行胎兒神經管缺陷風險評估。另外規範還指出了檢測前後遺傳谘詢工作的重要性，醫師應當對孕婦本人及其家屬詳細告知該檢測的目標病種、目的、意義、準確率、風險和局限性，以及檢測的種類、費用和技術流程。應當對孕婦提供檢測後臨床谘詢及高風險孕婦的後續處理，在知情同意的前提下對高風險孕婦進行產前診斷，並負責隨訪妊娠結局。
綜合國內外開展的臨床試驗及行業協會指導意見，首先是NIPT的定位問題。在臨床上此檢測主要定位成：高精度篩查、深度篩查、接近於診斷的篩查、高危人群的初篩等，雖然名稱不同且在臨床應用上還存在一定的局限性，但各國專家層麵都已經充分認識到了NIPT的高靈敏度、高特異度的技術特點，最終希望給該檢測一個更加貼合自己國家實際臨床情況的定位。其次是NIPT目前適用人群。由於NIPT作為目標疾病指向精確的產前篩查技術，目前還難以取代現有的產前篩查-診斷技術。因尚缺乏在中低風險孕婦人群中的臨床數據，目前隻推薦高危人群和有特殊需求的人群，包括高齡、血清學篩查高危、有不良孕史的孕婦等。再次，NSGC的遺傳谘詢指導意見顯而易見是針對目前該項檢測的局限性和風險而推出的。讓臨床醫生充分認識到這項檢測的局限性，這對臨床應用的正確使用十分關鍵。
最後，國內外的臨床產前專家及行業共識尚未對該項技術的詳細實驗操作、生物信息分析以及結果解讀推出標準。這預示著未來NIPT向臨床推進時仍需大量工作，不僅需要國家政策層麵的支持與規範和行業專家在大量臨床數據基礎上對此項技術做出更恰當的臨床定位，也需要從事新一代測序的技術專家給予技術層麵的支持，盡快推出適應我國臨床現狀的更全麵詳盡的技術標準及解讀方式。
參考文獻（略）
