在第三屆國際絡病學大會上，有多項臨床試驗、體外研究結果公布，其內容主要涉及通心絡對人體外周血內皮祖細胞（EPC）存活、增殖、遷移和黏附功能的影響，對通心絡膠囊治療冠心病的隨機對照試驗的係統評價、治療穩定型心絞痛的臨床療效及對內皮功能的影響，治療腦血管病隨機對照試驗的薈萃分析等。

　　我們將重點推薦第二軍醫大學附屬長征醫院吳宗貴等關於通心絡對人體外周血EPC遷移和黏附功能影響的實驗研究，廣州中山大學何穗智等關於通心絡膠囊治療冠心病隨機對照試驗的係統評價。

　　通心絡對人體外周血EPC增殖、遷移和黏附功能的影響（一）

　　自從1997年Asahara等首次發現外周血CD34+單個核細胞中含有血管EPC以來，人們已對EPC進行了大量的研究工作。EPC是血管內皮細胞（EC）的前體，可以動員到外周血中，遷移、歸巢到血管新生部位，並在遷移部位增殖、分化為EC，形成新的血管。它們在成體血管新生和受損內膜的再內皮化中發揮著重要作用。有關對EPC的研究成果為缺血性疾病、惡性腫瘤的治療和組織工程研究打開了新的視角。

　　血管內皮功能障礙是發生動脈硬化的啟動子，並貫穿於冠心病發生發展的全過程，因此逆轉失調的血管內皮功能是心血管疾病治療的新趨勢。

　　EPC參與人胚胎血管生成與出生後血管新生和內皮損傷的修複。新生血管中約25％的EC由EPC增殖分化而來。冠心病患者循環血EPC數量下降了近50%，且功能受損。增加循環血EPC數量、改善其功能是冠心病防治的一個新策略。

　　通心絡由人參、水蛭、全蠍、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤勺和冰片等8種成分組成，具有益氣活血、通絡止痛之功能，可以增加冠脈血流量，改善冠脈血供，抑製缺血再灌注心肌細胞損傷、縮小梗死麵積，恢複冠心病病人受損的血管內皮功能等作用。目前已廣泛應用於臨床心腦血管疾病的防治。

　　為探討通心絡防治心腦血管病的療效是否與其影響人體外周血內皮祖細胞相關，上海第二軍醫大學長征醫院吳宗貴教授領導的課題組，就通心絡對人體外周血EPC存活、增殖、遷移和黏附功能的影響及其機製進行了係列研究。

　　通心絡對人體外周血內皮祖細胞遷移和黏附功能影響的實驗研究

　　隨著對EPC的更深入研究，人們開始傾向於EPC補充治療，即移植高增殖活性的EPC，也稱“supply side”策略。上海第二軍醫大學長征醫院梁小衛、孫承波、王華、梁春、吳宗貴等觀察到，通心絡在一定濃度範圍內可使人血管EPC的遷移、黏附能力有明顯改善，並增加EPC數量。這進一步表明，通心絡可能具有促進血管內皮修複的作用，因而其在動脈粥樣硬化發生、發展過程中具有改善血管內皮功能的積極作用，可以預防及治療動脈粥樣硬化。

　　目的　研究中藥通心絡對體外培養的人體外周血內皮祖細胞（EPC）遷移和黏附功能的影響。 

　　方法　采用超聲溶解方法製備通心絡超微粉溶液，密度梯度離心法從外周血獲取單個核細胞，接種於人纖維連接蛋白包被培養板，培養7天後，洗去非貼壁細胞。采用激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPC，並進一步通過流式細胞儀檢測其表麵標誌物。貼壁細胞分別加入0、10、20、50、100、150、200 μl的通心絡超微粉溶液繼續培養0、6、12、24、36 h。通過觀察細胞形態及采用transwell小室、黏附能力測定實驗等檢測通心絡對EPC遷移、黏附能力的影響。

　　結果　通心絡不同濃度組均改善了EPC的遷移和黏附能力，其中100 μl、作用36 h的影響最為顯著[遷移能力：100 μl通心絡與對照組比較(23.2±1.7)對(15.3±2.0)，P＜0.01); 黏附能力：100 μl通心絡與對照組比較（43.8±4.7）vs（28.5±4.7），P＜0.01]。

　　結論　通心絡能顯著改善外周血EPC的遷移和黏附能力，在一定濃度範圍內呈明顯時效與量效關係。

　　1. 主要實驗試劑

　　淋巴細胞分層液、二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、M199、血管內皮生長因子（VEGF）、FITC標記荊豆凝集素Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ)、人纖連蛋白、Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白 （Dil―acLDL)、transwell小室（孔徑8 μm）、胎牛血清、胰蛋白酶、細胞超聲粉碎儀，通心絡超微粉（石家莊以嶺藥業股份有限公司）。

　　2. 通心絡超微粉溶液的製備

　　用培養基DMEM溶解通心絡超微粉，配置成10 mg/ml原始液，室溫條件下，充分震蕩10分鍾，超聲溶解1分鍾，以1000 g離心20分鍾後，除去沉澱物，保留上清用於細胞培養。

　　3. 細胞培養與鑒定

　　取健康成人外周血50 ml，用密度梯度離心法分離出單個核細胞，以5×106/cm2密度接種於鋪在預先包被有人纖連蛋白六孔板培養皿中，每皿中加入3 ml M199培養基(含20％胎牛血清,青黴素100 U/ml，鏈黴素100 U/ml，VEGF 10 ng/ml，BFGF 2 ng/ml)。置37℃ 5％ CO2飽和濕度培養箱中培養。4 d後，PBS洗脫非貼壁細胞，換培養液繼續培養。 

　　7 天後，細胞以0.25％胰酶消化，製成1×106 /ml的單個核細胞懸液，細胞與Dil-acLDL(2.4 μg/ml)37℃孵育1 h以檢測EPC對DiLDL的攝取。然後用2％多聚甲醛固定細胞10 min。固定後用PBS浸洗，將FITC-UEA-Ⅰ(10 μg/ml)加於上述標本中，在37℃下孵育1 h。通過激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-Ⅰ和DiLDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPC。

　　細胞懸液中加入熒光標記的CD34、CD133 10 μl（1 mg/ml），以成熟內皮細胞做對照組，流式細胞儀分析細胞CD34、CD133的表達。

　　4. 實驗分組

　　細胞培養7天後，無血清培養液M199過夜培養24 h。PBS洗脫非貼壁細胞，貼壁細胞隨機分成17個組，1～5組為對照組，為正常培養組，分別培養0、6、12、24、36 h，6～10組為通心絡100 μl組分別培養0、6、12、24、36 h，11～17組分別加入通心絡超微粉溶液0、10、20、50、100、150、200 μl的條件培養基培養36 h。

　　5. 形態學觀察 

　　普通倒置顯微鏡下觀察不同時期細胞的生長特點及形態。

　　6. EPC遷移能力測定

　　我們將不同處理組處理後的EPC用0.25％胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，製備成細胞懸液。於24 孔板中放入transwell小室（孔徑8 μm）。下室內加入600 μl含VEGF的M199培養液，將100 μl　1×105 EPC細胞懸液加入上室，培養於37℃ 5％ CO2飽和濕度培養箱中24 h。取出transwell小室，PBS淋洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細胞，將已經侵入並貼附於微孔膜下層的細胞固定於4％多聚甲醛10 ′，然後用0.25％結晶紫染色。隨機計數6個視野(×200)，以確定EPC遷移能力。

　　（未完待續）