準種（quasispecies）是由艾根（Eigen）首先提出用於描述同種生物遺傳異質性的概念，它特指不同病毒種群間有一定基因序列差異即基因異質性（差異一般不超過核苷酸序列總長度2%～5%） ，但尚不構成病原體不同基因型或血清型的現象。自然狀態下，準種通常由一種或幾種主序列以及一係列變異序列組成，當選擇壓力平衡時可維持相對穩定。乙肝病毒（HBV）具有的準種特性可能是引起乙型肝炎慢性化和抗病毒治療失敗的一個非常重要的病毒學因素。HBV準種概念的提出，為全麵認識HBV提供了新的角度，使人們對HBV存在狀態的認識產生了兩個重要的飛躍：從單一病毒到病毒群的飛躍以及由靜態到動態變化的飛躍。

圖 GS FLX 高通量測序方法原理示意圖 GS FLX高通量測序是一種依靠生物發光進行DNA序列分析的新技術，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶協同作用下，檢測係統可將每一個三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）的聚合與一次化學發光信號的釋放偶聯起來，通過檢測化學發光信號達到實時測定DNA序列之目的。該方法具有速度快、應用廣、讀取序列長、準確率高等優點，為準種的檢測帶來了革命性的突破。

　　HBV感染是全球麵臨的重大公共衛生問題，超過20億人曾感染HBV，其中近4億為慢性HBV感染者。慢性乙肝（CHB）是一種難治性疾病，α幹擾素與核苷類似物（NA）抗病毒治療是目前國際上公認的少數有效的治療方法。　

　　核苷類似物主要包括拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定（LdT）、替諾福韋（TDF）等，該類藥物具有抗病毒作用顯著、口服方便、安全性好等特點，但長期使用容易產生耐藥，限製了其臨床應用。　

耐藥突變位點檢測的局限性

　　耐藥是指由於HBV對藥物發生適應性突變，導致藥物抑製病毒作用敏感度下降的現象。核苷類似物特異性地結合於HBV聚合酶的底物結合部位，影響病毒複製。如果HBV聚合酶區基因突變，將導致某些特定部位的氨基酸被置換，使之與藥物的結合力下降，從而引起藥物敏感性降低和耐藥。　

　　目前已知的常見耐藥突變位點主要見於逆轉錄酶（RT）的A、B、C、D區。研究發現，LAM耐藥主要是由rtM204V/I/S原發耐藥突變以及rtL180M、rtV173L等繼發補償突變所致。LdT與LAM結構相似，其耐藥突變也基本相似。ADV耐藥主要與rtN236T或rtA181V原發耐藥突變相關。ETV耐藥突變則包括rtM204和rtL180兩個LAM原發耐藥突變位點以及rtT184、rtS202或rtM250的其中一個ETV原發耐藥突變位點，rtI169位點突變可能是一個補償突變。　

　　目前，對於HBV耐藥突變位點的檢測已經應用於臨床，特別是對已知的耐藥突變位點的檢測已成為臨床指導用藥的重要依據。一旦患者標本中檢測到已知的耐藥突變位點，就意味著耐藥已經或即將發生。對醫師而言，就要考慮調整用藥方案，以期達到最佳治療效果。　

　　但在臨床耐藥出現以前，我們還不能準確預測哪類患者會對哪一種核苷類似物產生耐藥，也不能準確預測什麼時間會產生耐藥。如何避免或延緩耐藥發生是迫切需要解決的一個重要臨床問題。　

HBV準種現象日益受到關注

　　大量臨床結果顯示，不同患者對同一核苷類似物的反應性不一樣，同一患者對不同核苷類似物反應也不同。越來越多的研究表明，核苷類似物的不同反應性與HBV存在準種現象有著密切的關係。　

　　如果臨床醫生能夠方便地獲得患者血清中HBV的準種特點，又能清楚地了解不同準種的HBV對不同藥物敏感性的差別，就可根據客觀依據優化抗病毒治療藥物的選擇和方案的製定，從而提高HBV感染者抗病毒治療的療效。　

　　新型高速測序技術，如GS FLX測序法避免了以前克隆測序法的費時費力，為準種的大規模高通量檢測提供了可能（見圖）。　

HBV準種特點對藥物反應性和耐藥性的影響

　　除了耐藥位點，HBV準種的以下特征對藥物反應性和耐藥性也有不容忽視的影響，對其進行監測可更好地指導臨床用藥。　

基線準種模式及比例

　　對於同一種核苷類似物，為什麼有的準種耐藥，有的準種敏感？不同準種藥物反應性的差異是否由基線準種的模式所決定？有研究發現，LAM治療患者發生病毒突破時幾乎總表現為無野生株存在的YMDD耐藥種群，無病毒突破時則表現為野生病毒種群或野生株與YMDD耐藥株混合種群。　

　　由此可見，從核苷類似物基因型耐藥出現到發生病毒突破之間可能存在一個病毒種群轉換時期，其中耐藥株種群含量與比例可能是預測病毒突破的一個有價值指標，但還缺乏相關研究報告。　

準種中劣勢株的組成和比例分布

　　準種中存在著不同比例的優勢株和劣勢株，優勢株和劣勢株隨著時間的推移和選擇壓力的作用會產生漂變。在藥物選擇壓力下，不同病毒種群所占的相對比率重新調整。基線時的劣勢株在核苷類似物的選擇壓力下，可能會轉換成優勢株。　

　　我們與其他學者都觀察到，臨床上有些耐藥病例並沒有檢測到已知耐藥相關突變，但仍表現為臨床耐藥，排除宿主因素外，這種不典型耐藥病例是否與基線時準種的組成，尤其是那些低頻（例如<10%或<5%）的準種譜有關，值得進一步研究。　

核苷類似物耐藥突變的氨基酸替換形式複雜多樣

　　研究表明，耐藥突變的氨基酸替換形式可影響病毒的耐藥性與複製能力，從而影響耐藥株篩選。不同氨基酸替換形式耐藥株在臨床耐藥和病毒突破中的作用不同。　

　　不同的核苷類似物產生的耐藥突變位點不一樣，隨著核苷類似物的長期使用，相信會不斷發現新的更多的有潛在價值的突變位點。開展病毒種群大規模深度測序，不但可以找到已知突變位點，同時也可以發現新的突變位點，從而對某些氨基酸替換形式在病毒突破中的預測價值作出評估，加深對病毒耐藥形成機製的認識。　

核苷類似物耐藥補償突變位點與耐藥的關係

　　對LAM的耐藥研究表明，rtV173L、rtL180M等補償突變和rtT128N、rtW153Q等疑似補償突變在病毒突破時出現的幾率明顯增高。ETV耐藥相關研究也發現，rtI169疑似補償突變在病毒突破時出現幾率明顯增高。　

　　原發耐藥突變使病毒對藥物敏感性下降，但通常病毒複製能力也隨之下降，繼續用藥仍可以獲得部分病毒抑製效果。繼發補償突變的篩選則可使耐藥病毒株的複製能力部分或全部恢複，此時病毒DNA水平可能明顯升高。因此，對耐藥補償位點的進一步檢測和發現非常必要。　

病毒準種複雜性和多樣性可能與病毒耐藥相關

　　病毒準種異質性越大，組成準種的病毒株就越複雜，其中包含的各種抵抗株可能就越多，其適應環境變化的能力就越強，臨床上藥物治療的難度可能就越大。　

　　有研究表明，反應性好和反應性差的患者準種複雜性和多樣性的動力學改變在LAM治療早期有不同的模式。治療4周時準種動力學改變的複雜性和多樣性與LAM抗病毒療效及病毒耐藥有關。　

不同基因型、混合感染、重組體都與核苷類似物抗病毒反應有關

　　研究表明，不同基因型對核苷類似物反應性不一，不同基因型的混合感染和重組體都使核苷類似物抗病毒療效更複雜，是否可將其作為監測指標還需大樣本研究。