北京佑安醫院 趙秀英

　　手足口病是一種由多種腸道病毒引起的常見傳染病，以嬰幼兒發病為主,流行無明顯地區性，一年四季均可發病，但以夏秋季多見，冬季發病較為少見。本病多數患者症狀輕微，以發熱和手、足、口腔等部位出現皮疹或皰疹為主要特征，少數患者可並發無菌性腦膜炎、腦炎、急性遲緩性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等。引起手足口病的腸道病毒包括腸道病毒71型（EV71）、柯薩奇病毒A組（CoxA）和埃可病毒（Echo）的某些血清型。EV71病毒是最難鑒定的腸道病毒之一，可引起與脊髓灰質炎病毒感染相同的急性馳緩性麻痹等臨床症狀，目前其感染引起重症病例的比例較大，故在對中樞神經係統疾病進行臨床診斷時，首先須行病原學判斷。本文主要介紹如何規範地采集手足口病患者的病原學樣本。

　　趙秀英主任醫師於2005年6月畢業於香港大學微生物學係，獲理學博士學位，現為北京佑安醫院臨床檢驗中心副主任、首都醫科大學臨床檢驗學係副教授、首都醫科大學碩士研究生導師。主要研究方向為感染與免疫、分子生物及免疫學診斷技術。

　　2011年，趙秀英副教授入選北京市“十百千”衛生人才選拔經費“百”層次培養計劃及北京市衛生係統高層次衛生技術人才學科骨幹項目。先後承擔首都醫學發展科研基金聯合攻關、國家自然科學基金、北京市自然科學基金及“十一五”肝炎、艾滋病科技攻關等多個項目。已在國內外核心期刊發表論文50餘篇，主編並出版專著兩部。

　　病例討論

　　患兒男性，3歲，因手掌出現水皰樣皮疹，伴口腔潰瘍、發熱、頭痛、嘔吐1天入院。

　　既往史 發病前1周其幼兒園同班同學曾被確診為手足口病。

　　查體 入院時患兒神誌清楚，腦膜刺激征陽性。

　　實驗室檢查 血常規示白細胞（WBC） 3.9×109 個/L，中性粒細胞占60%。尿、便常規無異常，肝功能及血生化正常。

　　入院診斷 手足口病，重型。

　　病情變化 入院後第1天與第3天采集咽拭子、第2天采集腦脊液行EV71與柯薩奇病毒A組16型（CA16）核酸檢測，結果均為陰性。而腦脊液檢查顯示，WBC為157個/μl（其中多核細胞占62%，單核細胞占38%），蛋白為22 mg/dl，糖為81 mg/dl。

　　入院3天後，患兒意識發生改變，第4天出現陣攣性抽搐，隨後昏迷，腦電圖示彌漫性高幅慢波。予鎮靜藥、甘油及地塞米鬆治療。入院第2周，意識逐漸恢複，但出現軀體性共濟失調，不能坐立，肢體肌力減退，此時查EV71 IgM為陽性。而後神經係統異常逐漸恢複。依據血清學檢查及表現，確診為EV71引起的全腦炎和腦幹腦炎。

　　問題 為何早期檢測EV71與CA16核酸結果均為陰性？

　　樣本類型及采樣方法

　　臨床對手足口病的病原學診斷包括：從患者血清、腦脊液、咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標本中檢測到病原核酸；自患者血清中檢測到特異性IgM抗體；患者急性期與恢複期血清IgG抗體有4倍以上的升高。

　　手足口病患者的其他實驗室檢查缺乏特異性，早期患者可能出現外周血WBC總數與淋巴細胞下降，血塗片可見單核異型淋巴細胞，病程持續較長或出現嚴重合並症者或有細菌或真菌感染表現，此時WBC可能升高。少數患者伴不同程度的肝髒或心肌損傷，轉氨酶或心肌酶譜可輕度升高。

　　目前，對手足口病患者進行EV71和CA16的逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測仍是其病原學診斷的主要方法，但部分臨床症狀符合手足口病診斷者的病原體EV71和CA16核酸檢測結果為陰性。這不但與樣本類型、采樣時間、檢測次數及患者病情有關，且也可能是患者感染了EV71和CA16之外的腸道病毒。

　　下麵介紹一下在采集不同標本過程中的注意事項，隻有全科醫生掌握了正確的標本采集方法，才能真正讓標本監測發揮其作用。

　　正確的標本采集方法

　　咽拭子標本

　　盡量采集患者發病3日內的咽拭子標本用於病原學檢測。相對於普通棉拭子，尼龍植絨拭子的采集與運送效果更好，尤其是不能及時送檢或放置時間較長的樣本。

　　取樣時適度用力拭抹咽後壁和兩側扁桃體，避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3~5 ml保存液（即含5%牛血清的維持液或生理鹽水）的15 ml外螺旋蓋采樣管，在靠近頂端處折斷棉簽杆，旋緊管蓋並密封，以防幹燥且注意低溫保存，因腸道病毒為RNA病毒，在體外或幹燥環境下生存力較弱。

　　咽拭子樣本也可用於病毒抗原的早期檢測。這須用試劑盒專用的病毒裂解液對樣本進行處理，不可直接使用上述保存液中的樣本檢測病毒抗原。

　　腦脊液標本

　　對於出現神經係統症狀者，可采集腦脊液標本進行病毒分離或核酸檢測。采集時間為出現神經係統症狀後3 d內，采集量為1.0~2.0 ml，采集後應立即裝入帶墊圈的無菌凍存管中。但EV71感染神經係統時，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。

　　皰疹液

　　皰疹液可用於病毒分離培養，也可用於RT-PCR檢測。應先用75%的酒精對皰疹周圍皮膚進行消毒，然後用消毒針將皰疹挑破，用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內裝3~5 ml保存液的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽杆，旋緊管蓋並密封。

　　血清標本

　　血清標本用於通過免疫學手段檢測EV71和CA16感染後的抗體。

　　采集急性期（發病0~7 d）和恢複期（發病14~30 d）雙份配對血清用於闡明和分析EV71或CA16感染後IgG和IgM抗體的動態變化。IgM抗體陽性有助於早期診斷，IgG抗體對流行病學調查有重要意義。

　　采集3~5 ml靜脈全血，置於真空無菌采血管中；自凝後，分離血清，將血清移至2 ml外螺旋的血清保存管中，將其置於-20 ℃以下冰箱中冷凍保存。血清樣本一般不適於檢測病毒核酸或抗原。

　　糞便或肛拭子標本

　　采集患者發病3 d內的糞便或肛拭子標本，用於病原檢測，肛拭子采樣也推薦使用尼龍植絨的采樣拭子。

　　從患者肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數下，拔出後,迅速將棉簽放入裝有3~5 ml保存液的采樣管中，旋緊管蓋以防幹燥。有研究顯示，使用糞便行腸道病毒核酸檢測的陽性率高於咽拭子檢查，采樣時間可延長至發病後5 d。因腸道病毒易於在胃腸道或鼻咽部存在，有時可在這些部位生長數周~數月，故須在這些部位進行病毒分離和進行RT-PCR檢測；即使結果陽性，解釋時還應謹慎，尤其是糞便檢測結果，也許今天患者糞便中發現的病毒是幾周前發生的感染。