環狀RNA(circRNA)是一種新興的內源性非編碼RNA(ncRNA)，它們參與細胞增殖、粘附、凋亡和存活等多個生物學過程[1]。
近年來，circRNAs在腫瘤領域也獲得了越來越多的關注。有研究表明許多circRNA能促進細胞周期發展，抑製或誘導腫瘤細胞凋亡以及抑製血管生成等等[2]，各種不同的circRNAs在腫瘤發生發展過程中起著不同甚至相反的作用。
雖然越來越多的研究報道了乳腺癌、肺癌和結直腸癌中異常的circRNAs[3]，但circRNAs在腫瘤細胞中的生物學功能、分子機製和環狀模式尚不清楚。此外，還有研究提出circRNAs可以通過病理功能未知的外泌體分泌到循環中[4]，且比線性RNAs更容易被分選進入外泌體。然而，circRNAs的外泌體特異性分選機製也仍然完全未知。
近日，來自浙江大學張紅河和中國藥科大學來茂德領銜的研究團隊，闡明了circRHOBTB3在結直腸癌(CRC)進展中的生物學作用、環化過程和分泌途徑，這一結果發表在Molecular Cancer期刊上。
他們發現，抑瘤circRHOBTB3通過外泌體被癌細胞排出，以維持結直腸癌細胞的活性。此外，他們還設計了靶向circRHOBTB3的環狀化和分泌元件的反義寡核苷酸(ASOs)，用於CRC的治療。
circRHOBTB3是宿主基因RHOBTB3轉錄後剪接和環狀化而產生的一種circRNA。RHOBTB3作為Rho GTPase家族ATP酶，參與膜轉運[5、6]和蛋白酶體降解[7]。
先前的研究也表明circRHOBTB3在CRC、卵巢癌、胃癌和肝細胞癌(HCC)中作為腫瘤抑製circRNA。然而，它的循環模式和外泌體分泌途徑並未被闡釋。
首先，研究人員分析了來自GEO數據庫的12例CRC患者、21例HCC患者、32例胰腺腺癌(PAAD)患者和14例健康供體的血清外泌體的總RNA-seq數據。
結果顯示，許多circRNAs在腫瘤患者血清外泌體中的表達程度不同，但在所有三種癌症來源的外泌體中，隻有hsa_circ_0007444(circRHOBTB3)均表達上調，且其宿主基因RHOBTB3在三種腫瘤組織中的表達與正常組織相比均無顯著性的增強。
然而，對來自浙江大學醫學院邵逸夫醫院體檢的18例CRC患者和16例健康供者的血清樣本數據分析發現，與健康供者相比，circRHOBTB3在CRC組織中顯著下調，而宿主基因RHOBTB3顯著上調。而且，在69個CRC組織樣本中檢測到的circRHOBTB3的表達結果顯示，circRHOBTB3水平較高患者的總生存期更好。
於是，研究者不禁假設，circRHOBTB3是否具有抑癌作用?
為了驗證這一點，他們先確定了CRC患者血清外泌體中的circRHOBTB3確實來源於腫瘤細胞而非基質細胞，且circRHOBTB3水平在來自NCM460細胞(正常的腸上皮細胞係)的外泌體中最低。進一步在RKO、HCT116細胞(CRC細胞係)中過表達或敲低circRHOBTB3，結果表明circRHOBTB3可以抑製細胞遷移和侵襲能力。
並且，他們通過對circRHOBTB3敲除/重新表達細胞係RNA-Seq數據的分析，以及RT-qPCR驗證發現，在circRHOBTB3敲除的細胞係中代謝、增殖和上皮間充質轉化(EMT)通路相關基因顯著上調，而circRHOBTB3的重新表達降低了這些基因的表達。此外，circRHOBTB3敲除的細胞係中ROS水平也顯著升高。
他們還發現circRHOBTB3的結合蛋白是ENO1和ENO2。也就是說，circRHOBTB3可能通過與ENO1和ENO2等代謝酶相互作用，調節細胞內ROS水平，抑製腫瘤細胞增殖和EMT。
為了驗證circRHOBTB3在體內的功能，研究人員將過表達circRHOBTB3的HCT116細胞(CRC細胞係)皮下注射到裸鼠體內，構建了異種移植瘤模型。研究發現，與不表達circRHOBTB3的對照(EV)組相比，circRHOBTB3過表達(circRHOBTB3-OE)組的腫瘤體積和重量都顯著更小，且細胞增殖能力也更弱。
而當他們在裸鼠脾髒接種實驗中觀察肝轉移表型時發現，circRHOBTB3-OE組肝轉移灶少於EV組。更為有趣的是，circRHOBTB3可以在異種移植瘤小鼠模型的血漿和尿液中檢測到，而在野生型小鼠的血漿和尿液中則沒有。此外，circRHOBTB3-OE組的血漿中circRHOBTB3的水平高於EV組。
根據這些數據，研究者們推測CRC細胞必須通過外泌體分泌抑製腫瘤的circRHOBTB3來維持腫瘤侵襲和轉移的特征，換言之，CRC細胞有特殊的“排毒”機製。
在隨後的研究中，研究人員發現了circRHOBTB3的環化機製，還發現circRHOBTB3本身的順式元件(141–240nt，141-165nt，216-240nt)可以調節circRHOBTB3通過外泌體的分泌過程。
之前已經有研究發現，ESCRT-II亞複合物作為一種RNA結合複合物，可以將RNA分選至外泌體[8]中。在該文研究中，他們發現SNF8可以結合到circRHOBTB3的141-240nt區域，促進circRHOBTB3被分選至外泌體並分泌到胞外。他們將這個過程被定義為“腫瘤外泌體逃逸機製”。
受上述研究結果啟發，研究人員設計了二代ASOs，以增加circRHOBTB3的環化並減少分泌，這有望成為一種新的癌症治療策略。
研究人員設計了三種二代ASOs：一個靶向負環化的元件(ASO-cir：266-290nt)和兩個外泌體分泌的元件(ASO-exo1：141-165nt，ASO-exo2：216-240nt)。
通過實驗他們發現，ASO-cir確實能增加circRHOBTB3的環化，但circRHOBTB3的分泌卻會同時增加;而ASO-exo1和ASO-exo2中，僅ASO-exo2(以下簡稱ASO-exo)既增加circRHOBTB3的胞內水平，又阻斷circRHOBTB3外泌體的分泌。因此，研究者們考慮進一步使用ASO-cir和ASO-exo，研究二者聯合治療對結直腸癌的特異性和抗腫瘤效果。
研究人員驗證了ASOs的聯合用藥的確比ASO-cir和ASO-exo的單獨用藥能產生更多的胞內circRHOBTB3，且小鼠實驗的結果符合預期：ASO-cir聯合ASO-exo確實顯著提高了脾髒原發病灶中circRHOBTB3的表達，還可顯著減少腫瘤惡病質，且能控製轉移。
總的來說，這項研究成果闡明了circRHOBTB3調節細胞間ROS和代謝途徑來抑製CRC的進展的機製，還且提出了一種新的腫瘤逃逸理論，即腫瘤細胞通過“排泄”腫瘤抑製circRNA來維持癌細胞的活性(“腫瘤外泌體逃逸機製”)。
更重要的是，他們設計的二代ASOs可以通過靶向環化和分泌來調控腫瘤抑製circRNA，以此促進癌症的治療效果。且他們的臨床數據顯示，在CRC患者中，85.7%(30/35)的腫瘤樣本攜帶的circRHOBTB3水平低於配對的正常樣本，而腫瘤樣本中circRHOBTB3的低表達與較差的預後相關。這讓我們更加相信，這種ASOs將成為未來針對CRC的一種有前途的治療策略。
