同濟大學附屬同濟醫院張春陽第二軍醫大學長征醫院鄒俊傑石勇銓曲衛孫亮亮劉誌民
摘要
目的研究超微粉（UT）和微粉（FT）兩種劑型通心絡膠囊(DM)對糖尿病SD大鼠腎髒氧化應激[包括抗氧化酶和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶]的影響。
方法分別給予鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠超微粉通心絡膠囊（UT-DM，1g/kg）或微粉通心絡膠囊（FT-DM，1g/kg），幹預4周後，檢測其腎功能、腎皮質抗氧化酶和NADPH氧化酶亞基mRNA表達的改變。
結果糖尿病大鼠腎皮質丙二醛（MDA）含量、24h尿蛋白（24hUP）和腎重/體重（KW/BW）比值增加，總超氧化物歧化酶（TSOD）活性降低，穀胱苷肽過氧化物酶（GSH-Px）活性升高，過氧化氫酶（CAT）活性無變化。UT-DM和FT-DM幹預均可明顯降低糖尿病大鼠腎皮質MDA、24hUP和KW/BW，增高TSOD和GSH-Px活性，對CAT活性無影響。其中UT-DM對24hUP、KW/BW、MDA、TSOD和GSH-Px的作用較FT-DM更明顯，差異有統計學意義。糖尿病大鼠腎皮質NADPH氧化酶亞基p47phoxmRNA表達水平增高，采用兩種劑型通心絡膠囊幹預後p47phox表達水平降低，兩種劑型之間差異無統計學意義。在各組間NADPH氧化酶亞基p22phoxmRNA表達的差異無統計學意義。
結論通心絡膠囊能增強糖尿病大鼠腎髒TSOD和GSH-Px活性，降低NADPH氧化酶p47phox的表達水平，可能因此抑製腎髒氧化應激反應，減輕糖尿病大鼠的早期腎髒損傷。
糖尿病時體內氧化應激水平明顯升高，抗氧化治療可以減緩並發症的發生和發展，因此氧化應激在糖尿病慢性微血管並發症的發生和發展中可能起重要作用。抗氧化酶包括TSOD、GSH-Px和CAT，是機體防止氧化應激損傷的重要因素。NADPH氧化酶是體內活性氧的一個重要來源，糖尿病時其表達和活性增強。
通心絡膠囊是根據中醫絡病學說研製的中藥複方製劑，具有活血通絡、改善和調整血管內皮細胞功能障礙的作用。我們的研究表明，UT-DM和FT-DM兩種通心絡膠囊均有抑製糖尿病大鼠腎髒氧化應激的作用，從而均能減輕糖尿病大鼠早期腎髒損傷，並且UT-DM的作用優於FT-DM。
材料和方法
材料
鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司。UT-DM和FT-DM兩種通心絡膠囊均由河北石家莊以嶺藥業股份有限公司提供。TSOD、GSH-Px、CAT和脂質過氧化物MDA測定試劑盒購自南京建成公司。血糖測定采用羅氏公司血糖測定儀。體重150~200g的雄性SD大鼠由上海實驗動物中心提供。
動物分組
研究者給予大鼠適應性飼養7天後分為:正常對照組(NC，n=8）和糖尿病組。對糖尿病組大鼠給予STZ[用前以0.1mol/L檸檬酸鹽緩衝液(pH4.5)新鮮配製]，以60mg/kg體重的劑量一次性腹腔注射，1周後於其尾靜脈采血測定血糖，以血糖>16.7mmol/L確定為糖尿病模型，然後按體重隨機分為：糖尿病對照組(DMC，7隻)、UT-DM（按每天1g/kg體重灌胃，n=8）組和FT-DM（按每天1g/kg體重灌胃，n=8）組。研究者給予NC和DMC大鼠等量生理鹽水溶液,每日灌胃給藥，持續給藥4周後處死。所有大鼠自由飲水，接受正常大鼠飼料和每周體重和血糖測量。
一般觀察指標
在實驗4周時,研究者予以實驗大鼠稱體重，測血糖，用代謝籠留24h尿液，測24hUP排泄量。空腹麻醉下經心髒采血，迅速取出腎髒，稱重，計算KW/BW比值，分離腎皮質並放入-70℃低溫冰箱保存備用。采用比色法測定腎皮質MDA、CAT、TSOD、GSH-Px水平。
NADPH氧化酶亞基p47phox和p22phox的mRNA表達取出100mg冰凍腎皮質，用trizol提取總RNA，電泳檢測RNA的濃度和完整性。
引物根據GenBank提供的大鼠p22phoxmRNA序列（NM_024160）、p47phox（NM_053734），利用PrimerPremier5.0自行設計引物。p22phox的上遊引物（5’-3’）為CGGGCTGTCCTCCACTTACTGC,下遊引物為TGATGGTGCCTCCAACCTGCG。p47phox的上遊引物(5’-3’)為GGACACCTATCGCCGCAACAG,下遊引物為GATGAGGTCCGAGCTGGGTCTC。引物由上海歐易生物科技有限公司合成。
RNA樣品反轉錄利用RNA反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄。試劑盒使用Fermentans公司的RNAPCRkit，按照試劑盒提供的反應體係進行反轉錄反應。
Real-timePCR利用takara公司的SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)kit進行逆轉錄聚合酶鏈反應（real-timePCR）檢測。PCR儀使用CorbetResearch公司的Rotor-Gene3000。采用軟件Rotor-Gene5.0及Excel7.0對實驗結果進行數據分析處理。
標準曲線的繪製將預試驗的PCR產物按照10倍濃度梯度進行稀釋，選擇1/1000、1/10000、1/100000、1/1000000濃度的稀釋產物作為標準品模版，進行real-timePCR反應。通過這四個標準品生成的反應數據，軟件Rotor-Gene6.0根據反應的熒光實時監控數據和標準品的濃度關係，生成標準曲線。通過此標準曲線計算標準曲線所劃定的CT值。
數據分析采用2－△△CT法比較待測指標mRNA在各組間表達水平的差異。
統計學處理
實驗數據用均數±標準差表示，各組間數據差異顯著性均采用方差分析和t檢驗，采用SPSS12.0統計軟件。
（末完待續）
