在一項研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員利用一種稱為循環排列(circular permutation)的技術，構建出一套稱為Cas9-CP的新型Cas9變體，這將簡化Cas9融合蛋白的設計，使得它們能夠用於除了簡單的DNA切割之外的多種應用，比如堿基編輯和表觀遺傳修飾。相關研究結果發表在Cell期刊上，論文標題為“CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification”。

通過這個相同的過程，這些研究人員將“永遠開啟(always-on)”的Cas9分子轉變為可激活的開關。這些開關保持在“關閉”位置，直到它們被蛋白酶激活。由此產生的蛋白酶感應的Cas9(protease-sensing Cas9, ProCas9)能夠減少脫靶效應並實現分子感應，以及組織或器官特異性的基因組編輯。他們證實ProCas9可用於檢測病毒蛋白酶，從而潛在地用作一種能夠引發免疫反應的病原體感應係統。

論文通訊作者、加州大學伯克利分校生物化學家David Savage說，“我們並沒有堅持使用大自然給我們提供的基因組編輯蛋白。這些蛋白能夠經精心優化後變成適合在人細胞中使用的支架。”

諸如Cas9之類的CRISPR-Cas蛋白保護細菌免受病毒入侵。這種細菌防禦係統已被改用於基因組編輯應用，比如讓各種細胞類型和有機體中的基因失活。Cas9已進化為一種細菌防禦係統，但是它不一定具有在哺乳動物細胞中進行基因組編輯所需的特性，比如基因組靶向時的極高準確度和精確度，或對這種酶在空間和時間上的活性進行控製的能力。

盡管構建出的Cas9融合蛋白有效地編輯DNA中的堿基，或者通過表觀遺傳修飾激活或抑製轉錄，但是每個新應用都需要深入的工程學方法並進行費時費力的優化。另一個主要障礙在於Cas9始終處於“開啟”狀態。缺乏對這種蛋白的活性的控製使得難以靶向特定細胞或組織，從而能夠導致不想要的基因組編輯和更大的脫靶基因組損傷，並且阻止使用Cas9作為細胞事件的分子記錄器。

為了克服這些障礙，Savage和他的團隊使用循環排列來重新設計Cas9的分子序列，因而更好地控製它的活性並為融合蛋白構建更優化的DNA結合支架。這種Cas9重新連接方法涉及將這種蛋白的末端(即它的氨基端和羧基端)與肽接頭(peptide linker)連接，同時在不同的位置上分割它的序列，從而產生新的相鄰的氨基端和羧基端。

這些研究人員發現Cas9對循環排列具有很強的延展性。這種蛋白的多個區域具有熱點，這些熱點可在多個位置上打開，從而產生多樣性的Cas9-CP，所產生的Cas9-CP可用作高級融合蛋白的支架。目前，Cas9的氨基端和羧基端是固定的，並且它們並不適合放置用於結合DNA的融合蛋白。相比之下，這些新的蛋白支架的末端更靠近這種蛋白的DNA相互作用界麵，並且經優化後可高效地構建融合蛋白。

這些研究人員接下來通過設計肽接頭來產生ProCas9，並且這種肽接頭足夠短以便將這種蛋白限製在沒有活性的狀態，隨後引入可利用匹配的病毒蛋白酶加以切割的序列。此後，這些ProCas9經調整後可作為利他的能夠檢測病原體並對它們作出反應的防禦係統。當通過切割這種肽接頭激活這些ProCas9時，它們產生大量的DNA損傷並殺死受感染的細胞。

論文共同第一作者、加州大學伯克利分校的Christof Fellmann說，“我能夠暢想一下各種生物醫學應用，在這些應用中，Cas9-CP和ProCas9將允許我們更好地了解疾病過程，並且能夠讓CRISPR-Cas基因組編輯和修飾的轉化應用更加安全。”

在未來的研究中，這些研究人員將致力於開發Cas9融合蛋白，用於堿基編輯和表觀遺傳修飾。此外，他們計劃測試ProCas9是否可用於構建完整的合成免疫係統。人們也可能開發對內源性蛋白酶敏感的ProCas9用於靶向特定細胞，比如對癌細胞的基因組進行編輯。Savage說，“我們的ProCas9係統在任何適合於控製Cas9的情況下都是有用的。”