在臨床中使用CRISPR/Cas9基因編輯的一個障礙是Cas9核酸酶可能會在錯誤的位點上切割DNA。在一項新的研究中，來自美國麻省總醫院和英國阿斯利康公司的研究人員描述了一種在整個基因組中預測這些脫靶突變的策略，並且在小鼠中證實經過精心設計的向導RNA(gRNA)鏈不會產生任何可檢測到的切割錯誤。相關研究結果於2018年9月12日在線發表在Nature期刊上，論文標題為“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”。論文通信作者為阿斯利康公司生物學家Marcello Maresca和麻省總醫院生物學家與病理學家J. Keith Joung。

        加拿大多倫多大學發育生物學家Janet Rossant(未參與這項研究)說，這項研究證實“你最好確保你擁有非常準確的gRNA”。她補充道，“這種方法是一種更好的在動物模型和人體中開展實驗之前測試一種gRNA的特異性的方法。”

        根據Maresca的說法，他所在的公司的一個長期目標是能夠使用治療性基因編輯來治療許多人類疾病。他在一封發送給《科學家》網站的電子郵件中寫道，“然而，實現CRISPR藥物的潛力需要開發能夠高效地修飾靶基因的方法，而且這不會對基因組中的其他地方產生任何影響。”

        脫靶切割能夠發生在對有機體沒有影響的基因組位點上，或者它們能夠破壞重要的細胞功能。當試圖預測Cas9可能會出錯的基因組位點時，科學家們通常從計算預測開始，但是這些計算預測依賴於針對它們的gRNA如何結合DNA和Cas9如何進行切割作出的假設。

        美國布朗大學神經科學家Kate O’Connor-Giles(未參與這項研究)說，“看到一種通過實驗手段確定脫靶位點的方法是激動人心的，這是因為這種方法不存在針對構成潛在脫靶位點的因素作出假設時引入的偏差。”

        為了開發出一種讓脫靶效應最小化的方法， Maresca團隊與Joung團隊合作。他們開發出的這種方法的第一部分---最初由Joung團隊開發並於2017年發表(Nature Methods, doi:10.1038/nmeth.4278)---是在體外完成的。首先，他們將基因組DNA ---在這項新的研究中，他們用的是小鼠基因組---切割為大約長300個堿基對的片段，隨後給這些片段連接上一係列讓DNA環化的接頭(adapter)。他們引入Cas9和gRNA的複合物，這種複合物在某些位點上切割環狀DNA，從而讓它線性化。

        另一批核酸酶會降解剩餘的未被切割的環狀DNA。通過這種方式，這些研究人員能夠對線性化的DNA進行測序，以便觀察Cas9切割(不論是有意的還是無意的)的位點並預測gRNA是否會導致體內脫靶效應。

        作為在這項新的研究中開發出的這種方法的第二部分，這些研究人員在小鼠中測試了他們的預測結果。當他們使用他們在體外發現的會在基因組中數千個錯誤位點進行切割的gRNA時，在他們檢查的一部分的預測位點中，超過40%的位點也在小鼠肝髒中發生突變。一個位點在體外篩選中出現的頻率越高，它在體內發生突變的可能性就越大。換句話說，在體外發生差錯的gRNA在體內也會發生差錯。

        這些研究人員還在體內實驗中檢查了小鼠基因組中的通過計算預測可能為脫靶位點但是迄今為止並未在他們的體外篩選過程中出現的位點。他們並沒有在這些位點上檢測到突變，這意味著他們的體外方法可能不會錯過真正的脫靶位點。

        對這些研究人員預測對靶位點具有高度特異性的另一種gRNA而言，他們在182個預測的位點中都未發現體內可檢測到的突變。

        O’Connor-Giles說，“真正的進步是檢測有機體特異性脫靶切割的實際能力，而不是依賴於並不一定反映你在正在使用的有機體(在臨床環境中，指的是患者)的遺傳環境的參考基因組序列。”鑒於使用來自特定患者或有機體體的基因組DNA進行體外篩選是可能的，因此來自測序步驟的序列讀取反映了測試對象基因組中可能存在的Cas9靶標。”

        Joung說，“這項[研究]應當會鼓勵進一步開發體內療法。它還為人們如何在整個有機體或體內環境中觀察這些潛在的脫靶位點提供了重要的藍圖或途徑。這一點是非常重要的，這是因為---尤其是出於研究目的---它讓你能夠評估對策略進行改善特異性的更改是否具有預期效果。”(生物穀 Bioon.com)

參考資料：

Pinar Akcakaya, Maggie L. Bobbin, Jimmy A. Guo et al.In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature, Published Online: 12 September 2018, doi:10.1038/s41586-018-0500-9.