陳原稼  教授，北京協和醫院消化內科研究員，教授，長期從事胃腸激素和腫瘤的研究，曾在美國國立衛生研究院（NIH）從事PET 的分子生物學研究，研究論文曾獲歐洲神經內分泌腫瘤學會年會論文一等獎。

　　對胰腺內分泌腫瘤（Pancreatic Endocrine Tumors，PET）的分子生物學研究不僅有助於了解這類腫瘤發生的分子機製，尋找治療的分子靶點，還有望發現有助鑒別腫瘤的良惡性病變、判斷其預後的分子標誌物。

　　PET是較為罕見的腫瘤,據美國最近發表的流行病學研究結果顯示, 從1973年到2004 年，神經內分泌腫瘤（NET）的發病率顯著上升, 其中PET的發病率從1973年的略低於0.2例/10萬人上升至2004年的0.32例/10萬人, 增長超過50%。在歐洲也有相似的報告。

　　PET是涉及多學科的疑難疾病, 其發生的分子機製不明。由於該類腫瘤臨床表現很複雜, 患者往往不能獲得及時的診斷。研究顯示，多數患者從發病到確診的時間是4~5年。所以，臨床上許多患者確診時已處於晚期, 失去了最佳的治療時機。此外，PET良惡性病變的鑒別和患者預後的判斷也是臨床上的難題。對於多數腫瘤, 病理診斷是鑒別良惡性病變的金標準，PET卻不一樣，其診斷隻能依據臨床上是否發現了腫瘤轉移和鄰近髒器的侵襲, 而非依賴病理專家的形態學判斷。所以，部分尚未發生侵襲轉移的惡性腫瘤, 即早期的惡性腫瘤不能獲得及時的診斷。腫瘤良惡性病變判斷正確與否，關係到診斷的準確性和後續的治療方案, 乃至患者的生命。

　　因此，對PET的分子生物學研究不僅有助於了解這類腫瘤發生的分子機製，尋找治療的分子靶點, 還有望發現有助鑒別腫瘤的良惡性病變、判斷其預後的分子標誌物。

　　家族遺傳性PET發生的分子機製

　　PET發生的分子機製尚未完全明確, 常見的抑癌基因p53、p16、Rb 和癌基因ras、fos、Src在PET中很少發生改變。

　　目前家族遺傳性PET的發病機製已明確，其中主要是抑癌基因MEN-1 相關的PET，在這部分家族遺傳性的腫瘤中,MEN1基因失活導致腫瘤發生。MEN1基因位於染色體11q13，其編碼的蛋白質Menin蛋白具有調控細胞的增殖和分化等多種重要的功能。Menin 蛋白可以和轉錄因子c-jun 結合，從而抑製細胞分裂增生，其還參與甲基轉移酶複合體的形成，促使組蛋白H3K4 甲基化，進而激活p27 基因和p18基因的轉錄, 從而抑製腫瘤的發生。一旦MEN1基因失活[主要是胚係突變和基因雜合缺失（LOH）], 就會導致多發性內分泌腺瘤病1型（MEN-1）的發生, 其中包括PET。

　　自從明確MEN1 基因失活導致MEN後，後來的研究發現，約20%的MEN患者和家係未能檢測出MEN1基因突變。在這些家係中發現，p27基因的胚係突變也能導致MEN的發生。此外, 還有極少數家族遺傳性PET 的發生與VHL 基因、NF2 抑癌基因失活有關。

　　散發性PET的分子機製研究進展

　　在散發性PET 中，部分腫瘤也能發生MEN1基因異常，但絕大部分散發性PET的分子病理機製仍有待進一步的研究。

　　近年來，國外研究顯示，約1/4至1/3的散發性PET發生MEN1基因突變，43%的散發性胃泌素瘤和17%的胰島素瘤發生了MEN1 基因的LOH。而我們的研究發現，40%的散發性胰島素瘤發生了MEN1基因的LOH。因此，MEN1基因在少數散發性PET的發生中也發揮一定作用。有研究顯示，僅約15%的PET 與VHL基因的異常有關。

　　今年，《科學》（Science）上發表的一項研究對散發性PET的近18000個編碼基因的外顯子進行測序。結果發現，44%的腫瘤細胞存在MEN1基因突變並導致基因失活，未發現K-ras基因和CDKN2A基因的突變，僅有3%的腫瘤有p53基因突變，這與之前的研究結果基本一致。

　　研究顯示，細胞周期蛋白（Cyclin）D1在散發性PET 中高表達，參與腫瘤的發生。而p27基因的失活會導致Cyclin D和CDK4的活性升高。

　　同樣和CDK4 相互作用的P16 蛋白是否參與PET 的發生頗有爭議，在PET 不同亞類之間，抑癌基因p16/INK4相關研究的數據不一致。有研究顯示，約45％的PET發生了p16/INK4 基因缺失、甲基化及突變，39%的無功能PET和10%的功能性PET發生了p16/INK4基因LOH；亦有研究表明，散發性PET中未見p16/INK4基因異常。我們針對胰島素瘤的研究發現，約90%的瘤旁胰島存在P16蛋白表達，而僅有27%的胰島素瘤表達該蛋白，約40%的胰島素瘤發生了p16基因啟動子的甲基化。

　　近年來，不少研究關注PET 的表觀遺傳學改變，63%~100%的PET存在抑癌基因RASSF1A 啟動子區的甲基化。該基因是目前已知的在PET 中甲基化頻率最高的基因，尚未明確該基因的失活在PET 發生過程中的作用。

　　此外，有相當比例的PET 發生O6-MGMT 基因（40%）、錯配修複基因hMLH1（23%）和RAR-β 基因的甲基化（25%）。我們最近的研究也發現，約1/3的胰島素瘤發生hMLH1的甲基化，且該基因啟動子的甲基化是導致基因失活的主要機製之一。另外，我們在胰島素瘤中發現，RAR-β 和MGMT 基因的甲基化率高達90%和86%，顯著高於研究報告的40%和25%。這些基因高甲基化的腫瘤生物學意義還有待深入研究。

　　近日，歐洲學者利用芯片技術檢測PET中microRNA 的表達後發現，數十種microRNA在PET中表達上升或下調，其中miR-221 和miR-222 在PET 中表達上調，這兩種microRNA可以和p27/CDKN1B基因的3’端非編碼區結合，抑製p27基因的翻譯從而降低其蛋白表達水平。因此，miR-221和miR-222 有可能參與PET的發生發展。miR-103、miR-107 和miR-21 的表達在PET 中也有顯著改變，有潛在的腫瘤生物學意義。

　　PET的分子預後指標

　　研究認為，PET患者的預後主要取決於腫瘤本身的特性，而與腫瘤分泌激素的多少無關，例如肝轉移是胃泌素瘤最為重要的預後指標。

　　有些臨床預後指標往往須較長時間的隨訪才能獲得。此外，Ki-67 免疫組化（IHC）染色陽性率＞2%時提示腫瘤有惡性病變的傾向，但Ki-67的IHC結果並不能反映所有腫瘤的惡性行為。我們研究發現，在胰島素瘤中，Ki-67 IHC陽性與否和腫瘤的良惡性病變無關。筆者在和歐美學者交流時，有學者也認為，Ki-67作為單一的指標有其局限性。因此，近十年來學者們希望通過探尋分子標誌物，以準確地判斷PET的預後。

　　盡管MEN1基因異常對於部分PET的發生至關重要，但該基因異常是否能夠預測PET的預後尚有爭議。既往研究普遍認為，MEN1基因突變或LOH與PET患者預後無關，但近期有研究發現，與MEN1基因野生型PET 患者相比，突變型患者生存期顯著延長（P=0.01）。該研究提示，MEN1基因突變是PET患者預後良好的分子標誌物。

　　在今年歐洲神經內分泌腫瘤學會年會上，有部分專家認為，應重新認識和評估MEN1基因在PET中的預後價值。

　　美國NIH 的研究顯示，胃泌素瘤中表皮生長因子受體（EGFR）和肝細胞生長因子受體（HGFR）的過表達與胃泌素瘤肝轉移及腫瘤治愈率下降顯著相關（P值分別為　　0.034和0.027）。研究還發現，在胃泌素瘤中，癌基因HER2/neu（EGFR 家族成員）信使RNA（mRNA）的過表達也與胃泌素瘤肝轉移顯著相關，這提示EGFR、HGFR 和HER2/neu的過表達在胃泌素瘤中有一定的預後價值。另外，1號染色體長臂的LOH與胃泌素瘤患者的預後差顯著相關。

　　我們的研究首次發現，1 號和22 號染色體長臂的LOH和胰島素瘤的惡性相關：發生染色體1q21.3-23.2 LOH 的胰島素瘤有58％為惡性，而該區域無LOH的腫瘤僅8％ 為惡性（P=0.014）；此外，發生染色體22q13.3 LOH的胰島素瘤有43％為惡性，而無該LOH的腫瘤僅8％為惡性（P＝0.009）。而之後荷蘭學者發表的研究亦發現，染色體1q23.2和22q13的LOH與胰島素瘤的惡性相關。

圖1 胰島素瘤的HE染色

 

圖2 IHC 示腫瘤細胞核中MHL-1 蛋白表達丟失

圖3 IHC 示hMSH2 蛋白的表達

　　2009年，我們研究發現，散發性胰島素瘤存在廣泛的微衛星不穩定和錯配修複基因MHL-1 表達的下降（見上圖）。微衛星不穩定和MHL-1蛋白表達下降與胰島素瘤的惡性顯著相關（P=4.8×10-6 和P=0.033），且與患者預後差顯著相關（P=0.001 和P=0.006）。此外，研究還發現，33%的惡性胰島素瘤存在hMSH2蛋白表達下調，而在良性腫瘤中這種下調發生率僅為5%（P=0.019）。這提示，DNA錯配修複基因異常可能是胰島素瘤發生和進展的機製之一，且檢測基因表達下降和微衛星不穩定可作為鑒別散發性胰島素瘤良惡性病變的分子標誌物。

　　近日，我們和美國紀念斯隆-凱特林（Memorial Sloan-Kettering）癌症中心及加州大學洛杉磯分校（UCLA）希達西奈山（Cedars-Sinai）醫學中心合作，首次在隨訪的約200 例PET 患者中發現: 腫瘤表達NF-66蛋白患者的總生存率顯著高於不表達NF-66蛋白者（P=0.02），該蛋白的表達和腫瘤良惡性顯著相關（P=0.001）（研究尚未正式發表）。這提示，NF-66 蛋白可作為PET患者預後和良惡性病變鑒別的分子標誌物。

　　展望

　　盡管PET是較為罕見的腫瘤，但近年來對這類腫瘤的研究卻並不少見。PET分子生物學研究取得的進展會極大地提高該類腫瘤的診斷、預後判斷和治療水平。例如，《新英格蘭醫學雜誌》在今年2月發表的研究證實，使用雷帕黴素（mTOR）抑製劑治療分化好的晚期胃腸胰腺神經內分泌腫瘤已獲得較為理想的效果。這些治療原理正是基於腫瘤mTOR信號通路的分子生物學研究而發展的。

　　總體來說，目前散發性PET 的發病機製仍不明確，因為PET包括多種亞類，例如胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、胰島素瘤和無功能胰腺內分泌瘤等，這些腫瘤既有共同點也有異質性，其發病的分子機製或許有所差異。因此，PET的分子病理機製比我們預期想象的要複雜很多，而腫瘤的分子標誌物有著非常重要的臨床實用價值，值得進一步探索。