【CMT&CHTV 文獻精粹】

導語：腎透明細胞癌(ccRCC)是一種惡性程度較高的腫瘤，其發病機製複雜，與VHL基因的突變和HIF-2α信號通路的異常激活緊密相關。近年來，盡管針對HIF-2α的抑製劑如Belzutifan已獲得FDA批準用於治療VHL相關腫瘤，但治療響應率不高，且易產生耐藥。最新研究進展表明，代謝酶ACSS2在ccRCC中扮演著關鍵角色。ACSS2，即乙酰輔酶A合成酶2，負責將乙酰鹽轉化為乙酰輔酶A，是細胞代謝過程中的重要酶。在ccRCC中，ACSS2的表達與患者預後不良相關，但其在腫瘤生長和HIF-2α信號傳導中的具體作用尚不明確。

2024年6月，《The Journal of Clinical Investigation》發表題為“HIF-2α expression and metabolic signaling require ACSS2 in clear cell renal cell carcinoma”的文章，探索ACSS2在ccRCC中的作用機製，以及其作為治療靶點的潛力，揭示了ACSS2在ccRCC中的多重作用機製。

研究方法概述

該研究采用了多種實驗方法來探究ACSS2在透明細胞腎癌(ccRCC)中的作用及其對HIF-2α信號通路的影響。以下是研究方法的概述：

體外實驗：

細胞培養：使用了ccRCC細胞係(如786-O和A498)進行實驗。

ACSS2抑製：通過使用藥理學抑製劑(ACSS2i)或轉導含有shRNA的病毒載體來降低ACSS2的表達。

細胞增殖和生長評估：采用BrdU摻入實驗和晶體紫染色來評估細胞增殖和生長情況。

腫瘤球形成實驗：評估ACSS2抑製對腫瘤細胞形成腫瘤球能力的影響。

體內實驗：

動物模型：使用NOD scid IL2Rgnull (NSG)小鼠進行腫瘤異種移植模型實驗。

腫瘤形成和治療：將ccRCC細胞注射到小鼠體內，然後通過口服或腹腔注射給予ACSS2抑製劑。

分子生物學技術：

蛋白質提取和西方印跡分析(Western blot)：用於檢測HIF-2α和其他相關蛋白的表達水平。

免疫沉澱：用於研究MUL1與HIF-2α之間的相互作用。

免疫組織化學和免疫熒光：用於分析ACSS2和HIF-2α在組織樣本中的表達和定位。

基因表達分析：

ATAC-seq：用於分析ACSS2抑製對染色質可及性的影響。

NanoString nCounter Metabolic Pathways panel：用於評估ACSS2抑製對代謝途徑相關基因表達的影響。

代謝分析：氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)：用於定量分析膽固醇和其他脂質。

形態學分析：透射電子顯微鏡(TEM)：用於觀察ACSS2抑製對線粒體形態的影響。

功能性分析：Mitochondrial biogenesis assay：用於評估ACSS2對線粒體生物合成的影響。

研究結果

ACSS2在ccRCC中的作用

研究首先揭示了ACSS2在ccRCC中的重要作用。通過在786-O和A498細胞係中使用ACSS2抑製劑(ACSS2i)或shACSS2，觀察到HIF-2α水平的顯著降低，同時抑製了體外細胞生長。具體數據顯示，在24小時處理後，所有劑量的ACSS2i均顯著減少了BrdU摻入，表明ccRCC細胞係的增殖能力受到了抑製。此外，3D腫瘤球形成實驗也表明ACSS2i處理顯著降低了腫瘤球的形成能力。

ACSS2抑製對腫瘤生長的影響

在體內模型中，通過給予小鼠ACSS2i或通過誘導shACSS2表達，觀察到腫瘤生長和最終腫瘤重量的顯著減少。通過給予15 mg/kg ACSS2i處理的小鼠，其腫瘤體積和重量均顯著小於對照組(P< 0.05;P< 0.0005;P< 0.0001;P< 0.001)，這表明ACSS2在腫瘤生長中起著關鍵作用。

ACSS2對HIF-2α穩定性的調控

研究進一步探討了ACSS2對HIF-2α穩定性的影響。通過使用蛋白酶體抑製劑MG132預處理細胞，發現在ACSS2抑製後，HIF-2α的表達得到了顯著恢複，這表明ACSS2可能通過促進HIF-2α的蛋白酶體降解來降低其穩定性。此外，ACSS2i處理還導致自噬和蛋白酶體途徑的激活，這可能進一步促進了HIF-2α的降解。

MUL1與HIF-2α的相互作用

研究還發現了一個新的調控HIF-2α穩定性的機製，即E3泛素連接酶MUL1與HIF-2α的相互作用。通過免疫共沉澱實驗，證實了MUL1與HIF-2α的結合，並發現ACSS2抑製劑處理並不影響這一相互作用。此外，MUL1的過表達能夠降低HIF-2α蛋白水平，並減少HIF-2α下遊靶基因的表達。

ACSS2對代謝途徑的影響

ACSS2的抑製對ccRCC細胞的代謝途徑產生了廣泛影響。通過NanoString代謝途徑檢測和ATAC-seq分析，發現ACSS2抑製導致膽固醇代謝途徑的顯著變化，以及染色質可及性的減少。這些結果表明，ACSS2促進HIF-2α的轉錄和蛋白質表達，還可能通過改變代謝途徑和染色質狀態來影響ccRCC細胞的表型。且ACSS2對ccRCC生長和HIF-2α信號傳導的調節直接依賴於ACSS2酶活性。

ACSS2酶活性對腫瘤生長的影響

研究最後探討了ACSS2酶活性對腫瘤生長的影響。通過使用催化失活的ACSS2突變體(ΔT376K)，發現隻有野生型ACSS2(WT-ACSS2)能夠恢複因ACSS2缺失導致的HIF-2α表達下降和細胞生長抑製，而ΔT376K則無法完全恢複。這表明ACSS2的酶活性對於維持ccRCC細胞的HIF-2α表達和促進腫瘤生長至關重要。

總結討論

研究揭示了ACSS2在ccRCC中的多重作用機製。ACSS2的抑製不僅能夠降低HIF-2α水平，還能夠影響腫瘤細胞的代謝途徑和染色質狀態。特別是，ACSS2與MUL1相互作用的發現，對於HIF-2α穩定性的調控有了新的了解，可能有助於開發針對HIF-2α的新藥物。此外，ACSS2抑製劑在體外和體內模型中均顯示出對ccRCC生長的抑製作用，這為未來的臨床試驗提供了有力的前期數據。考慮到HIF-2α在ccRCC中的中心作用，ACSS2抑製劑可能成為一種有效的治療手段，尤其對於VHL突變的ccRCC患者。這些發現對基礎科學研究具有重要意義，也有望改善ccRCC患者的預後。

參考文獻：

Bacigalupa ZA, Arner EN, Vlach LM, et al. HIF-2α expression and metabolic signaling require ACSS2 in clear cell renal cell carcinoma[J].J Clin Invest. 2024;134(12):e164249. Published 2024 Jun 17. doi:10.1172/JCI164249

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