腫瘤轉移是引起腫瘤相關死亡的重要原因，然而目前我們對腫瘤轉移以及轉移瘤形成的機製還不是非常清楚。
腫瘤的轉移是一個多步驟的過程，早在原發瘤剛形成時便有腫瘤細胞脫離原位向外播散[1]，但是轉移瘤的形成往往滯後很多，這可能是由於腫瘤細胞會在轉移部位進入休眠。腫瘤細胞的休眠可以防止其被免疫係統清除，有助於其在轉移部位的散播以及定植[1]，而一旦其從休眠中“覺醒”，則會導致轉移瘤的形成。
近日，由約翰·霍普金斯大學布隆伯格公共衛生學院Ashani T. Weeraratna教授領銜的研究團隊在著名期刊Nature上發表研究成果[2]，他們發現衰老的肺部微環境可以誘導休眠的黑色素瘤細胞轉變為增殖活躍狀態，從而形成肺部轉移瘤。機製上，WNT5A是促進轉移黑色素瘤細胞進入休眠的關鍵分子;而衰老的肺部成纖維細胞可以分泌WNT5A拮抗劑sFRP1，從而打破了黑色素瘤細胞的休眠使其進入活躍的增殖期，促進轉移瘤的形成。
這項研究成果清晰地揭示了在衰老肺部中黑色素瘤細胞結束休眠的機製，加深了我們對腫瘤轉移以及轉移瘤形成的理解，並且為我們後續開發抗腫瘤轉移療法提供了參考。
黑色素瘤是一種惡性皮膚癌，有著較強的轉移能力。有研究發現，相比於年輕小鼠，植入老年小鼠皮膚的黑色素瘤雖然生長更加緩慢，但是卻更容易發生肺轉移[3]。目前尚不清楚這是由於來自原發瘤的轉移性腫瘤細胞數增加，還是因為衰老個體肺部微環境變化促進了轉移瘤形成。
為了探究這個問題，Weeraratna教授研究團隊為年輕小鼠(8周齡)以及老年小鼠(52周齡以上)皮內接種了mCherry+黑色素瘤細胞，並使用免疫組織化學染色(IHC)檢測接種後不同時間點小鼠肺部mCherry+腫瘤細胞的數量。
實驗結果顯示，雖然在接種後第3周，兩組小鼠肺部定植的mCherry+腫瘤細胞數沒有明顯區別，但是接種後第5周老年小鼠肺部形成了明顯的腫瘤灶，而年輕小鼠卻沒有。IHC檢測發現年輕小鼠肺部定植的腫瘤細胞增殖標誌物Ki67大多為陰性，而老年小鼠肺部腫瘤細胞基本為Ki67陽性。這些數據提示衰老的肺部有利於腫瘤的增殖與轉移瘤形成。
為了進一步驗證衰老的肺部微環境才是導致腫瘤生長更加迅速的原因，研究團隊構建了尾靜脈轉移模型，發現在注射了同樣數量的腫瘤細胞後老年小鼠肺部出現更多的腫瘤結節，這表明衰老的肺部微環境是導致腫瘤轉移負荷增加的原因。
在皮內以及尾靜脈接種腫瘤細胞後，老年小鼠肺部出現更多的轉移灶
那麼引起腫瘤細胞在衰老個體肺部生長更加迅速的原因是什麼呢?
此前有報道稱，皮膚中成纖維細胞是導致年輕小鼠與老年小鼠黑色素瘤生長以及轉移差異的關鍵角色[3];因此，研究團隊將黑色素瘤細胞與來自年輕(35歲或以下)或老年(55歲或以上)健康捐贈者的人皮膚或肺成纖維細胞共同培養，進行3D膠原重建，觀察腫瘤細胞的生長速度。
結果與小鼠活體實驗一致，黑色素瘤細胞在老年肺成纖維細胞微環境中的增殖速度比在年輕肺成纖維細胞環境中的黑色素瘤細胞更快，而在老化的皮膚成纖維細胞微環境中的黑色素瘤細胞比在含有年輕皮膚成纖維細胞的微環境中的黑色素瘤細胞增殖更慢。使用來自成纖維細胞的條件培養基進行2D細胞培養也得到了相同的結論，這說明衰老個體的肺成纖維細胞分泌的可溶性物質在促進黑色素瘤生長的過程中發揮了重要作用。
為了進一步尋找成纖維細胞用來促進腫瘤生長的物質，研究團隊對健康的年輕人和老年人的肺成纖維細胞的分泌物進行了蛋白質組學分析，發現老年人肺成纖維細胞分泌更多的sFRP1——一種非經典的WNT通路抑製分子。
衰老個體肺部成纖維細胞能夠促進腫瘤細胞增殖，並且這可能是通過可溶型分泌物介導的
因為WNT5A被證明可以促進多種腫瘤細胞的休眠[4]，所以研究團隊猜想，sFRP1可能是通過抑製WNT5A信號，從而使腫瘤細胞從休眠中醒來，恢複增殖。
為了證明這個猜想，他們使用來源肺成纖維細胞的條件培養基培養黑色素瘤細胞，發現來自老年肺成纖維細胞的培養基能夠顯著抑製黑色素瘤細胞中非經典的WNT5A信號，並降低休眠相關基因表達，而增加增殖相關基因的表達。更進一步的，研究團隊使用重組FRP1處理黑色素瘤細胞，發現其也能夠起到抑製WNT5A信號、降低休眠標誌基因表達而增加增殖標誌物的表達;當敲低老年肺成纖維細胞中的sFRP1後再將其與黑色素瘤細胞共培養則發現腫瘤細胞的生長變緩。這些數據表明，老年肺成纖維細胞可能是通過分泌sFRP1來喚醒休眠的腫瘤細胞。
為了在體內實驗中驗證上述發現，研究團隊在給老年小鼠皮內接種mCherry+黑色素瘤細胞3周後(此時小鼠肺部已經有單個腫瘤細胞定植)為小鼠注射sFRP1中和抗體，觀察小鼠肺部腫瘤生長情況發現，中和sFRP1後小鼠肺部腫瘤結節數明顯減少，並且增殖標誌物Ki67的水平顯著低於IgG對照組。這些數據表明衰老肺部中的成纖維細胞可以通過分泌sFRP1結束腫瘤細胞的休眠，從而促進轉移瘤形成。
sFRP1能夠喚醒休眠的腫瘤細胞，促進轉移灶形成
鑒於上述結果提示WNT5A在腫瘤細胞休眠中有重要作用，研究團隊選擇將其作為肺轉移性黑色素瘤休眠的主要因素進行研究。通過TCGA數據庫分析，他們發現WNT5A的表達與多種休眠標誌物呈正相關，而與增殖標誌物呈現負相關;並且在多個黑色素瘤數據集中均發現WNT5A的高表達與腫瘤的侵襲性呈現正相關。因此，研究團隊猜想：WNT5A的表達有助於腫瘤的遠端侵襲，但是形成轉移瘤需要下調WNT5A的表達以增強腫瘤細胞的增殖能力。
為了在體內實驗中驗證上述猜想，研究團隊構建了他莫昔芬(DOX)誘導的細胞係，可以在DOX處理下誘導表達針對WNT5A的shRNA從而降低WNT5A的表達量。在為小鼠皮內接種該腫瘤細胞後第3天或第21天開始給予小鼠DOX處理以降低WNT5A的表達，發現不論在哪個時間點進行DOX處理均能加快原發瘤的生長;而在第3天開始DOX處理使肺髒中定植的腫瘤細胞數顯著減少;在第21天開始DOX處理則使肺髒出現更多的腫瘤結節。這些數據表明WNT5A能夠促進腫瘤細胞的侵襲與定植，但是減弱了腫瘤細胞的增殖能力。
e,f：在年輕荷瘤小鼠中誘導腫瘤細胞敲低WNT5A促進肺部定植的腫瘤細胞增殖，形成轉移灶;g,h：在老年荷瘤小鼠中誘導腫瘤細胞過表達WNT5A抑製轉移灶形成
上述結果證明了WNT5A在調控腫瘤細胞侵襲與增殖中的關鍵作用，研究團隊想知道WNT5A是如何被調控的，他們將目光放在了TAM家族酪氨酸激酶受體家族上。根據已有的研究報道[5-9]，他們推測在黑色素瘤細胞中AXL與MER的差異表達可能構成了轉移組織中腫瘤細胞的休眠-再激活軸。
為了在體內探究MER以及AXL在腫瘤轉移以及休眠-再激活中的作用，研究團隊構建了DOX誘導過表達MER的黑色素瘤細胞係。在給年輕小鼠皮內接種腫瘤細胞後第3天或第21天開始給予小鼠DOX處理，發現隻有在第21天開始DOX處理才能夠增加肺髒中轉移灶的數量，而在第3天開始DOX處理顯著減少了肺髒中定植的單個腫瘤細胞數量。這些數據表明，原發瘤的擴散需要低表達MER(與WNT5A相反);而在肺內定植後，上調MER表達則有利於形成更大的轉移灶。同理，借助DOX誘導過表達AXL的黑色素瘤細胞係，研究團隊並在老年荷瘤小鼠中證明，AXL可以誘導腫瘤細胞休眠，抑製定植的腫瘤細胞增殖形成明顯的轉移灶。
f-h：上調MER有助於肺部定植腫瘤細胞增殖形成轉移瘤，但抑製原發瘤的轉移能力;m,n：上調AXL誘導肺部定植腫瘤細胞休眠，抑製轉移瘤形成
總的來說，這項研究成果清晰地揭示了衰老個體肺部微環境變化對肺轉移瘤形成的影響，這有助於理解腫瘤的遠端轉移與複發機製，並且有助於在未來開發針對休眠腫瘤細胞的治療策略。同時這篇論文也讓人好奇WNT5AHigh休眠腫瘤細胞與腫瘤幹細胞之間有怎樣的關係，它們是否是同一群細胞?腫瘤幹細胞是否需要WNT5A信號維持靜息狀態?
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