靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)免疫療法已經在複發/難治性急性淋巴白血病(ALL)等惡性血液腫瘤的治療中取得了令人驚喜的效果，多中心臨床試驗數據表明患者接受CAR-T治療後的完全響應率可達70-90%。目前，美國 FDA 已經批準了6款自體 CAR-T 細胞產品上市，用於治療白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤等血液類癌症。大量的臨床應用結果證明了這種個性化的療法極具抗癌潛力，沒有免疫排斥的風險，安全性也比較高，給全球眾多癌症患者帶來了希望。

遺憾的是，隨著隨訪時間的增長，有30-60%的病人在回輸 CAR-T 後一年以內複發。根據癌細胞表麵抗原的表達情況，複發可分為 CD19 陰性和 CD19 陽性兩大類，前者主要由癌症 B 細胞 CD19 表達丟失或下調導致，而後者的分子機製尚不清楚。

2022年6月8日，耶魯大學生物醫學工程係樊榮教授團隊與賓夕法尼亞大學 J. Joseph Melenhorst、Pablo G. Camara 團隊合作，在 Science Advances 期刊發表了題為：Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with ALL 的研究論文。

該研究對從2012年在賓夕法尼亞大學醫學院和費城兒童醫院啟動的全球首批臨床試驗中12名複發/難治性 B-ALL 病人的總計超過10萬個回輸前(Pre-infusion)4-1BB 結構 CAR-T 細胞進行了單細胞精準分析，揭示了 Th2 功能在 CD19 陽性複發病人中的缺失。

該結果進一步通過獨立的流式分析和 IsoPlexis 分泌蛋白檢測在49名病人的 CAR-T 功能特性表征中得到了驗證。

根據患者的臨床反應，研究團隊將12名患者分為長期完全緩解組(CR，超過54個月無複發，n=5)，CD19 陽性複發組(RL，中位複發時間=9.6個月，n=5)和無響應組(NR，n=2)，獲取了 CAR-T 細胞在未激活、CD19 抗原特異性激活、T 細胞受體激活和非靶點激活條件下的全基因轉錄組和14種表麵蛋白組信息。

通過細胞因子共表達模塊分析，研究團隊首先發現在抗原特異性激活條件下， Type 2 (Th2)細胞集中分布在 CR 組 CAR-T 富集的區域，且 Th2 模塊在 CR 組中的比例顯著高於 RL 組。高度差異表達基因分析進一步識別到了 Th2 相關細胞因子 IL4、IL5、IL13 在 CR 組的上調和 Th2 pathway 的顯著激活。

接下來，對 CR 和 RL 病人 CAR-T 細胞集的聚類分析識別出8個具備獨特轉錄組特征的亞群，其中亞群4中的細胞具有突出的 Th2 功能。通過細胞占比統計，發現 CR 組 CAR-T 在亞群4中的比例顯著高於 RL 組。此外，從 IL4、IL5、IL13 以及主導 Th2 細胞分化的轉錄因子 GATA3 的單細胞表達分布點狀圖中可以看出，無論是表達水平還是表達頻率，CR 組5名病人都明顯高於 RL 組。

為了驗證上述發現，研究團隊額外表征了49名 B-ALL 病人的 CAR-T 細胞，其中26名病人具備中位33.7個月的無複發完全響應，另外23名病人在中位9.3個月發生 CD19 陽性複發。雙方研究人員獨立開展了胞內流式分析(賓夕法尼亞大學)和 IsoPlexis 自動化分泌蛋白檢測(耶魯大學)，兩種方法共同證實了 Th2 功能在 RL 組中的缺失。

該項研究通過細胞因子共表達模塊、無監督學習聚類和經典信號通路分析從激活 CAR-T 的功能異質性中識別出了 Th2 功能在維持 CAR-T 長久緩解中的重要作用，揭示了當前 CAR-T 細胞免疫療法領域十分關切的 CD19 陽性複發機製，為臨床實踐中預測響應和篩選病人提供了目標基因、明確了關鍵通路，也為提高 CAR-T 功效和改善治療效果提供了理論基礎。