小細胞肺癌(SCLC)是一種侵襲性神經內分泌(NE)惡性腫瘤，占據肺癌約13~15%，以快速倍增，早期轉移和預後不良為特征[1]，5年生存率不足7%[2]。這些患者當中70%出現擴散，隻能接受全身治療[3]。
目前針對SCLC的臨床治療手段主要是依賴以鉑類藥物為主的化療或者化療/免疫療法的聯合[4]。由於免疫治療較低的臨床應答率，目前以DNA損傷藥物為主的化療依舊是轉移期SCLC全身療法的重要支柱[5]。然而，SCLC強大的獲得性耐藥能力使得化療不僅起效短暫且容易複發[6]。但導致SCLC獲得性耐藥的機製依舊撲朔迷離。
近日，由美國德州大學西南醫學中心Benjamin J. Drapkin和美國麻省綜合醫院癌症中心Nicholas J. Dyson領銜的研究團隊，在Science Advances上發表的重要研究成果嚐試解答了這一問題。
他們的研究表明部分患者複發的SCLC中跨損傷DNA合成 (TLS) 的上調可以誘導此類患者對聯合OT(PARP抑製劑奧拉帕利聯合DNA烷化劑替莫唑胺)引起的DNA複製損傷的耐受。這是導致SCLC產生獲得性耐藥性的關鍵因素，而使用TLS抑製劑可以克服這種耐藥性[7]。
研究發現的TLS 的上調是在 SCLC 患者的腫瘤細胞中鑒定出的第一個與獲得性耐藥有關的特定分子機製。
DNA損傷藥物作為SCLC全身治療的主流藥物麵臨著快速且短暫的藥物反應。隨著連續複發，在治療中獲益的患者比例顯著下降[8]。SCLC腫瘤也從單純的藥物響應狀態逐漸演變為獲得性耐藥狀態。
參考轉移性NSCLC治療的成功範例可知[9]，在複發時，重新對腫瘤樣本活檢可以比較治療前和複發後樣本，以了解獲得性耐藥機製的概況並開發克服耐藥性的療法。
相比之下，由於再次活檢在SCLC中缺乏臨床意義，所以配對的治療前/複發後腫瘤樣本極為罕見。而已獲得的少數複發後樣本或是經過固定的，或是經過冷凍的。這些複發後樣本無法用於確認具體的耐藥變化，這導致大部分對於SCLC的耐藥性研究隻能基於假設。
另外，關於SCLC對DNA損傷藥物的耐藥性研究缺乏臨床相關性模型。實驗室藥物方案通常在劑量和時間上與臨床給藥不同，並且在複發後患者的樣本或模型中未得到證實的情況下，尚不清楚這些實驗係統能否很好地模擬臨床耐藥性[10]。總的來說，目前尚未對SCLC的獲得性耐藥達成共識或找到臨床上可行的機製。
基於以上問題，作者使用多個臨床時間點中SCLC患者的循環腫瘤細胞，活檢和積液樣本作為腫瘤來源建立了患者來源的異種移植(PDX)模型，治療前/複發後匹配的PDX對用以發現化療耐藥機製[11]。
作者進行了一項單臂1/2期臨床試驗，對SCLC複發患者聯用PARP抑製劑奧拉帕利與DNA烷化劑替莫唑胺(聯合OT)。
從對OT試驗具有持久反應的兩名患者(MGH1518 和 MGH1528)中獲得了OT治療前和OT後複發PDX模型，用以模擬從臨床敏感性到獲得性耐藥的轉變。其中，對OT高度敏感的預處理PDX模型，稱為PDX sens 1518和PDX sens 1528。而對OT具有高度耐藥性的模型，稱為PDX res 1518和PDX res 1528。
研究人員利用全基因組測序證實了這些腫瘤中的高突變負擔。然而，這種突變負擔的大量增加幾乎都與治療相關，導致難以從遺傳譜中發現耐藥機製。
抗 OT 的 SCLC 模型顯示複發後腫瘤突變負荷大量增加
轉變思路，作者對OT耐藥SCLC進行奧拉帕利和替莫唑胺(TMZ)藥效實驗，發現對於OT獲得性耐藥SCLC，奧拉帕利抑製PARylation或TMZ引起DNA損傷的能力沒有顯著差異。
然而，彗星實驗和γH2AX免疫檢測證明OT在兩種MGH1518模型中均誘導單鏈DNA斷裂(SSB)，但PDX res 1518不再將OT誘導的SSB轉化為雙鏈DNA斷裂(DSB)。這些結果表明OT烷基化DNA並抑製蛋白質PARylation從而在兩種模型中誘導SSB，但在PDX res 1518中，獲得性耐藥機製阻止了DSB和γH2AX病灶的積累。
PDX res 1518細胞在OT處理後表現出更少的DNA雙鏈斷裂
由於SCLC對DNA損傷藥物的敏感性隨細胞周期進程而變化，奧拉帕利和TMZ對S期的細胞具有更強的細胞毒性。
作者通過腫瘤組織免疫檢測和scRNA測序發現：PDX res 1518比PDX sens 1518中有更多的細胞處於G1期。作者由此假設這種細胞周期分布可能有助於SCLC對OT產生獲得性耐藥並建立了以下模型以揭示OT的即時和延遲細胞效應。
PDX sens 1518和PDX res 1518均在體內給予單劑量的奧拉帕利和TMZ，並在治療4或24小時後切除腫瘤。在PDX sens 1518中，受損細胞或在G2期中積累或未能完成DNA複製;而在 PDX res 1518中，幾乎所有的DNA 損傷都集中在S期群體中。
此外，前者中每個細胞的增殖能力發生進行性下降，並且在治療5天後，幾乎所有腫瘤細胞都無法增殖。相反，後者增殖能力在給藥1天後基本不受影響，在治療3天和5天後反而增加。這些結果表明PDX res 1518細胞中G0或G1期細胞對OT具有耐藥性，並且可以在治療期間和治療後促進腫瘤生長。
PDX1518兩種模型的細胞周期分布及OT多次給藥後兩者細胞增殖能力
隨後，研究人員在短期培養的PDX細胞中探究了，是否進行OT治療情況下的DNA複製動力學。在未經處理的MGH1518模型中，複製叉速度相似，但在OT存在時它們出現差異，即：在PDX sens 1518細胞中DNA複製逐漸減速，而PDX res 1518細胞幾乎沒有變化。
從理論上講，因為沒有誘導損傷，PDX res 1518中的複製叉可能對OT不敏感，但前文中對OT處理的細胞的堿性彗星測定表明情況卻與此不符。因此，作者猜想複製叉可以通過TLS等耐受機製暫時繞過OT誘導的損傷，即：高保真複製DNA聚合酶被可以繞過DNA損傷的低保真TLS聚合酶取代。
為了驗證這一猜想，作者在TLS 抑製劑(TLS pp)的存在下重複DNA纖維測定，結果表明：單獨使用TLSpp治療減慢PDX res 1518複製叉的效果較弱，但與OT結合使用，其導致複製叉明顯減速。隨後，作者測試了 TLS 抑製使SCLC模型對OT重新敏感的能力。與預期相符，在體外抑製TLS使PDX res 1518細胞對OT敏感。
此外，在SBC-5、COLO-668、NCI-H82、NCI-H2029、SW1271、DMS53、NCI-H526和NCI-H841等SCLC的細胞係上使用OT + TLS pp的組合均比單獨的OT更有效。
在 PDX res 1518 SCLC細胞中TLS抑製劑與OT具有協同作用
而MGH1528模型則表現出不同的耐藥機製，盡管PDX res 1528表現出對OT的獲得性耐藥，但PDX sens 1528和PDX res 1528對由OT和γ射線輻照誘導的DSB沒有差異;此外，OT對PDX res 1528更弱的DNA損傷能力與細胞周期所處階段無關;最後，使用TLS抑製劑亦不能使得耐藥細胞更敏感。
以上均表明PDX res 1528與PDX res 1518通過不同的機製對OT產生獲得耐藥性。這也反映了SCLC的異質性及其獲得性耐藥機製的複雜性。
總的來說，作者構建並比較了來自治療反應性患者的治療前和複發後PDX模型，鑒定出TLS上調和/或過度激活賦予SCLC對DNA損傷藥物的獲得性耐藥，並且在部分情況下，通過添加TLS抑製劑可以部分恢複SCLC對OT的敏感性。此外，這種連續腫瘤采樣的方法有助於在臨床中診斷SCLC獲得性耐藥機製，據此可能提供活檢所需的臨床生物標誌物，從而繞過或消除這種耐藥機製。
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