意義
瘤內異質性（ITH）對於確定和跟蹤癌症演變成為越來越受關注的主題。然而，ITH對臨床預後風險的預測仍不清楚。本文描繪了由ITH驅動的患者分層，我們還提出在非小細胞肺癌（NSCLC）中開發單扇區預測多基因檢測（MGT）時，應考慮個體基因的ITH水平。
源自患者的富集循環腫瘤細胞（CTC）的單細胞分子分析，可進一步揭示預測轉移風險的生物標誌物。通過對轉移譜多個步驟的基因進行係統分析，我們證明NSCLC複發早期患者具有精確的特征，可以據此識別高危患者。
摘要
盡管非小細胞肺癌（NSCLC）不僅在腫瘤之間，而且在腫瘤內都具有顯著的基因組和轉錄組異質性，但是驗證臨床相關基因標記的預測依賴於單個組織樣本，包括兩種商業上可獲得的多基因測試（MGTS）。
本文中，我們報告了瘤內異質性（ITH）對預測NSCLC複發風險具有意料之外的影響，強調需要更好的基因組策略來改善預後。
利用無標記、慣性聚焦微流體方法以單細胞分辨率捕獲循環腫瘤細胞（CTC），我們進一步識別了具有不同轉移能力的CTC表達譜基因特征。
值得注意的是，調和ITH和CTC衍生基因表達數據的預後風險精確模型，優於預測無複發生存（RFS）的初始分類器。我們提出量身定製的方法來提供可靠的風險評估，同時考慮到NSCLC中ITH驅動的變化幅度。
針對白種人吸煙肺癌患者群體的新興多區域測序提供了瘤內異質性（ITH）的基因證據。
正文
最近，我們觀察到一種複雜的基因組，盡管突變負擔低，但在不吸煙的亞洲非小細胞肺癌（NSCLC）中具有不同的拷貝數和早期多樣化。
這種ITH在多種分子水平上的臨床預後在其他類型癌症中也變得明顯，表明ITH驅動的差異可能導致錯誤的患者分類。然而，目前沒有多基因檢測（MGT）支持ITH特征選擇，包括基於2個基因表達的肺癌患者MGT。
通過將預測多基因分類器應用於多區域數據分析，我們首先描繪了轉錄組ITH，並檢查了ITH對NSCLC患者分層的混淆程度。
該分類器被稱為腫瘤基質指數（TMi），已被證實其在2,000多名早期NSCLC患者中具備對預後和輔助化療反應的預測價值。
TMi是基於29個基質基因表達水平計算的，主要編碼非核心基質蛋白，包括細胞外基質（ECM）調節因子（MMP12、MMP1、ADAMTS5）、ECM附屬蛋白（GREM1、SFTPC、SFTPA2、SFTPD、FCN3）、分泌因子（S100A2、CXCL13、WIF1、CHRDL1、CXCL2、IL6、HHIP、S100A12）和其他ECM相關成分（LPL、CPB2、MAMDC2、CD36），以及包括膠原蛋白（COL11A1, COL10A1, COL6A6)）和ECM糖蛋白（SPP1、CTHRC1、TNNC1、ABI3BP、PCOLCE2）在內的核心基質分子，與匹配的無腫瘤組織相比，我們發現這些成分在NSCLC中存在更加差異化的表達。
我們發現，盡管TMi是有效的預後預測因子，但是大量的TMi基因顯示出顯著的ITH並導致同一腫瘤內的不一致分布（同時具備低TMi和高Tmi區域），這表明需要基於ITH水平和患者異質性（IPH）重建基因特征，正如新近對乳腺癌MGT提出的那樣。
我們假設，在原發性腫瘤侵襲過程中伴隨腫瘤進展的異常matrisomal表達模式也可能是有用的，因此可以在轉移的晚期進程中表現出來，如出現在循環血中。
因此，除了多區域原發性腫瘤組織外，我們還評估了循環腫瘤細胞（CTC），以描述預後性TMi特征的腫瘤內表型變異。
最近的單細胞測序研究表明，時空異質性CTC可以監測各種轉移性惡性腫瘤的基因組和轉錄組水平。
雖然單個腫瘤活檢可能並不能代表含有空間隔離克隆的整個腫瘤，但CTC的空間和時間變化可能會重現在原發性和轉移性癌症的基因表達和途徑。
我們進一步采用單細胞而非大量細胞分析來排除可能的白細胞汙染，這在轉錄組學研究中尤為明顯，當活化的白細胞同時過度表達癌症相關基因、上皮細胞間質轉型和幹細胞標記物。鑒於間充質和造血特性，CTC特異性轉錄物的表達分析複雜化。
我們小組最近開發了一個集成的ClearCell FX和微流體平台工作流程，以：
1）測量來自單個患者的CTC全長mRNA轉錄組
2）檢測在匹配的原發性腫瘤中發現的顯性突變。
兩項研究中的高質量測序性能指標證明了ClearCell FX富集CTC的遺傳完整性，證明了將無標記、標記非依賴性微流體技術納入下遊分子分析和功能研究的可行性。
最近在不同的外部實驗室進行的單細胞測序研究進一步證實，通過DEPArray技術分離的富含ClearCell FX的CTC或經過全基因組擴增（WGA）的顯微操作器提取的DNA質量高、適合測序、顯示出穩健性。
通過對2,748個患者樣本進行係統的計算機驗證，我們進一步表明，新開發的風險模型僅包含單個CTC衍生的特征，專門針對ITH水平定製，具有強大的預測能力，可用於預測基於組織的樣本的無複發生存期（RFS），此類方法可能取代先前確定NSCLC複發高風險早期疾病患者的方法。
結果
ITH驅動的患者錯誤分類
為了檢驗ITH對風險預測的影響，我們分析了最近發表的2項研究的手術樣本（每個腫瘤3或4個區域）的多區域基因表達譜，使用預後性TMi基因組。我們首先檢查了TMi的診斷和預後準確性。在研究1中，TMi在區分正常和腫瘤樣本方麵取得了極好的診斷準確性，包括來自20個早期NSCLC腫瘤的80個區域和20個匹配的正常肺組織，其中敏感性、特異性ROC曲線下麵積均為100％。
為了測試TMi的預後性，我們將研究2的10名NSCLC患者的35個區域根據無複發生存（RFS）分析的理想分界指數分為低TMi和高TMi組。在這個小型患者隊列中，預測由模型複發的腫瘤具有顯著更差的預後，證明了TMi對RFS預測的穩健預測值。
討論
CTC的單細胞分析揭示了臨床上有用的拷貝數變異和點突變，同時解決了肺癌的異質性程度。然而，這些發現僅與表達上皮標誌物的CTC相關，缺失去分化的EpCAM-或間充質/ EMT樣CTC，這些都與疾病進展和治療反應密不可分。
通過依賴無標記方法，我們發現NSCLC腫瘤的轉移潛力在於其在基質表達中的異質性特征，其反過來反映在CTC群體中。
根據支持EMT對CTC表型貢獻的非排他性假設的結果，原發腫瘤中的TMi高細胞可能在功能上具備其在血流和轉移性生態位形成中所需的關鍵特性，特別是考慮到基質和EMT。
在最近的臨床研究中，表達間充質特征的CTC重複性與轉移的出現相關，它們在器官特異性轉移中的異質性的作用，進一步指向這些侵襲性細胞作為預測轉移的主要成分。
論文信息:
Addressing cellular heterogeneity in tumor and circulation for refined prognostication. PNAS September 3, 2019 116 (36) 17957-17962
