2016年年底，來自加州大學伯克利分校的幾位科學家在Nature Reviews Drug Discovery(影響因子47.12)雜誌上發表了一篇題為“Cornerstones of CRISPR–Cas in drug discovery and therapy”的綜述文章。CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna教授是這篇文章的共同作者。
基因組編輯工具CRISPR–Cas係統的飛速發展引發了生物學領域的一場革命。基於CRISPR–Cas的技術實現了幾乎無限製的基因操作，包括在人類細胞中。在這一綜述中，作者們討論了CRISPR–Cas如何通過加速高價值靶點識別和驗證、發現高可信度的生物標誌物以及開發不同的突破性療法影響下一代藥物的開發。文章關注了這一革命性基因編輯技術將帶來的希望，以及存在的缺陷和障礙，討論了不同CRISPR–Cas篩選平台的關鍵特性，提出了基因組編輯應用的最佳實踐方案。
文章在摘要中指出，通過在哺乳動物模型係統和人體組織中實現快速、準確地改變基因組信息，基於CRISPR–Cas係統的基因編輯技術已準備好要改變藥物研發的多個階段。此外，在患者中直接的體細胞編輯將最終從根本上改變成藥空間(druggable space)。大量的研究證實了CRISPR–Cas係統多種巧妙的應用。
這一綜述主要包括以下四個部分：1)CRISPR–Cas作為一種藥物發現工具(CRISPR–Cas as a tool for drug discovery);2)CRISPR係統的特異性(Specificity of CRISPR systems);3)利用CRISPR–Cas開發治療方法(Using CRISPR–Cas to make therapeutics);4)定義通往臨床之路(Defining a path to the clinic)。
第一部分：作為一種藥物發現工具
精準細胞模型
DNA測序的發展及其大規模的應用讓人們認識到了患者群體和普通人群之間的遺傳變異，同時擴大了我們對遺傳變異與疾病傾向、疾病發展以及治療響應之間關聯的理解。這些進展刺激了個性化醫學或精準醫學的發展。然而，實現這兩種醫學模式往往需要精準的遺傳模型，用以評估擁有未知重要性的突變，優化患者的分類，開發已批準藥物的新適應症以及替代性的治療模式。經典的同源重組技術可用於生成相關的細胞模型，但需要消耗大量的勞動力和時間，阻礙了其在藥物開發中的廣泛使用。CRISPR–Cas基因組編輯技術的出現大大改了這一現狀。短短4年的時間，它已被全球的科研人員接受並使用。
功能篩選
隨著研究人員揭開不同篩選係統的優缺點，CRISPR–Cas大規模的功能篩選功能同時也在發展和進化。由於設計有效sgRNAs的簡便性，以及能夠用於幾乎任何細胞類型或組織，CRISPR–Cas篩選係統很快在各種情況下被采用。作者們比較了幾種篩選平台的作用、機製、靶點選擇性等特點。
快速產生動物模型
除了在細胞培養中的應用，基因組編輯也顯著改變了我們產生疾病動物模型的能力。事實上，在CRISPR–Cas工具發展不久後，它們就已被用於動物模型構建中。它的出現之所以會帶來新的希望，是因為傳統的基因靶向(gene targeting)在除小鼠之外的臨床前模型中依然是困難的。這幾年，CRISPR–Cas技術已被用於編輯大鼠、狗、獼猴。這些動物模型也常用於臨床前的藥物開發。
第二部分：CRISPR係統的特異
盡管基於CRISPR的工具很容易靶向基本上任何的基因組位點，但它們也會產生脫靶編輯。脫靶位點是由核酸酶和sgRNA序列決定的。因此，科學家們開發出了大量預測sgRNA有效性和脫靶位點的算法。在這部分內容中，作者們談到了如何係統性地最小化CRISPR–Cas的脫靶效應。他們提到的3個方向是：1)需要兩個Cas9切口酶，部分相關成果於2013年以“Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity”為題發表在Cell雜誌上;2)依賴sgRNA或蛋白質工程實現更高的特異性;3)嚴格控製細胞中活躍的Cas9酶的數量。
第三部分：利用CRISPR–Cas開發治療方法
除了用於產生強大的研究工具或模型，CRISPR–Cas技術本身也具有發展成藥物或療法的巨大潛能。在該部分內容中，作者們討論了治療用基因編輯的現狀，以及CRISPR–Cas將如何對這一領域做出貢獻。
利用基因編輯開發CAR-T細胞療法
近幾年，癌症免疫療法領域快速發展，科學家們也迅速將基因編輯技術應用到其中。目前，有大量的研究集中在將這一技術應用到CAR-T療法的開發中。
目前，大部分的CAR-T細胞是利用患者自身的T細胞來產生。這是一個昂貴、耗時的過程。這一過程還受限於當前的生產製造能力。如果科學家們能夠想辦法生成通用型的CAR-T細胞，這類療法將有望變得更便捷、更便宜。因為，這些現成的(off-the-shelf)細胞將增加能夠接受單一CAR-T細胞產品治療的患者數量。
移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)和宿主排斥依然是這種“off-the-shelf”途徑的主要障礙。包括ZFNs 和 TALENs在內的基因編輯技術已經在一些研究中被用於克服這些障礙。在這裏，小編為大家插播一項1月9日發表在Nature Medicine雜誌上題為“Donor CD19 CAR T cells exert potent graft-versus-lymphoma activity with diminished graft-versus-host activity”的研究。由美國紀念斯隆凱特林癌症中心的科學家領導的研究小組發現，同種異體供體CD19特異性的CD28z-CAR-T細胞在促進抗淋巴瘤活性的同時，所導致的GVHD發生的風險是最少的。
除了用於產生“off-the-shelf”版本的CAR-T細胞，基因組編輯技術還可以通過敲除編碼T細胞抑製性受體或信號分子的基因(如CTLA4、PD1)提高CAR-T細胞的功效。在這部分內容中，作者們提到了美國NIH下屬Recombinant DNA Advisory Committee批準的將由CAR-T大牛Carl June教授領導的一項CRISPR臨床試驗。在該試驗中，研究人員將利用Cas9在黑色素瘤靶向的CAR-T細胞中敲除編碼PD-1的基因以及內源性T細胞受體的基因。此前，據Nature Biotechnology雜誌報道，研究團隊計劃在今年第一季度開始I期臨床試驗。
這裏也為大家插播一項Carl June教授去年11月在Clinical Cancer Research雜誌上發表一篇論文(Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition)。研究證實，體外和動物模型研究中，CRISPR基因編輯CAR-T細胞表現出了強有力的抗腫瘤活性。TCR和I類HLA雙重缺陷的T細胞同種異體反應性(alloreactivity)降低，且沒有導致GVHD。此外，同時三重基因組編輯(增加了對PD-1基因的編輯)增強了CAR-T細胞的體內抗腫瘤活性。
該綜述也提到了由我國四川大學華西醫院腫瘤學家盧鈾教授研究小組率先開展的全球首個CRISPR–Cas臨床試驗。雖然這一試驗沒有引入CAR，但利用Cas9敲除了來自肺癌患者T細胞的PD-1。一些類似的用PD-1敲除T細胞(PD1-knockout T cells)治療前列腺癌、膀胱癌和腎細胞癌的試驗也在啟動中。
與ZFNs 和TALENs等其它基因編輯技術相比，CRISPR–Cas能夠極快地測試任何新提出的基因改造。目前，CAR-T療法開發者與專門從事基因編輯的公司之間已建立了大量的合作，其中包括Novartis與Intellia Therapeutics 和 Caribou Biosciences、Juno Therapeutics與Editas Medicine。此外，致力於異體CAR-T療法開發的Cellectis公司從明尼蘇達大學獲得了一項使用TALENs的許可。
作者們表示，未來的CAR-T療法將受益於內源性T細胞受體基因、組織相容性基因以及信號通路組成的聯合改造。不過，需要注意的一點是，通過刪除這些抑製性信號提高CAR-T活性的同時，也要保證CAR-T細胞不會失控增殖。
體外基因編輯治療
文章還指出，造血係統是體外基因編輯的最佳目標。因為所需細胞可以從外周血樣本中快速獲得，且能夠在被改造和擴增後進行回輸。作者們在該部分中介紹了一些基於造血幹細胞基因編輯治療HIV的研究進展。
第四部分：關於臨床
談及基因編輯技術的臨床之路，作者們稱，體外研究和動物模型預測基因編輯療法在人類中副作用風險的能力一直備受矚目。最終，患者、醫生和監管機構必須討論在每個情況下可接受的風險等級，並開發適當的安全措施。
結論
CRISPR–Cas工具已被用於許多先前基因操作相對棘手的細胞和有機體中。尤其在哺乳動物模型係統和人類細胞中，這些技術能夠加速功能基因組學揭示細胞機製，鑒定或驗證新的藥物靶點。利用CRISPR–Cas編輯動物將產生人類疾病更好的模型，更具預測性的安全性測試，並改善患者的分層以及治療方案。此外，基因編輯技術的發展也有望幫助產生創新的療法，包括癌症T細胞療法、重編程iPSCs療法。作者們稱：“我們相信，基因編輯已經準備好對實際的藥物開發產生直接的影響。”CRISPR-Cas將成為下一代轉化療法(Transformational Therapies)和治療模式的關鍵。
