最近，Grail準備投資10億美元計劃招募7000初診癌症和3000 健康人群，致力於腫瘤血檢早期診斷標記物的開發[1]。腫瘤血液檢測要爆發了嗎?

從技術外行和使用者的角度吐槽一下腫瘤液體活檢的進展和前景。拋磚引玉。

正文

腫瘤液體活檢與傳統組織活檢的優劣勢比較

前年初參加腫瘤液體活檢會議的時候，還覺得它離實際應用還遠，FDA的指南也含糊其詞。一年多過去，已經有多款液體活檢伴隨診斷產品獲FDA批準，或已經得到眾多臨床數據，準備審報了。液體(血清) 活檢的發展真是可以用日新月異來形容。

液體活檢主要包括血液中的循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)， cell-free DNAs (cfDNA)， 外泌體(exosome)等。CTCs 火了幾年，在2013年到達高峰後發現應用有許多局限，被迅速崛起的cfDNA取代。外泌體發現還比較新，雖然發展迅速，但離應用還有距離。這裏主要討論cfDNA的進展，主要是伴隨診斷和藥物療效實時跟蹤方麵的應用。

血檢與組織檢測相比優勢在於：方便，快速，即時，便宜，微創。

更重要的是，血檢能夠挽救許多組織樣品難以獲得 (when tissue is an issue)，或組織樣品數量、質量不高的患者獲得靶向療法，或參與臨床研究的機會。比如，完成超過30，000臨床測試的Guardant Health報道，血檢方法挽救了高達50.2%的臨床患者的靶向突變基因的信息，這些患者要麼組織樣品難以獲得，要麼樣品質量不高，沒有檢測到致癌突變。

不是所有腫瘤細胞都會將突變的碎片DNA釋放到血液中，不同種類的腫瘤的血檢檢出率也不一致。據Guardant Health的報道，肝癌檢出率最高，約為92%，非小細胞肺癌89%，最低的膠質母細胞瘤檢出率隻有57%。這是血檢的最大的限製性硬傷之一。也是組織活檢永遠都有價值的依據所在 (仍舊是金標準)。

血清cfDNA檢測還有許多其它挑戰性因素，比如：

· DNA片段小，50-200 bp(峰值165 bp)。

· 半衰期短，30 分鍾，之後穩定。

· 低含量/豐度：低nM/mL 血清。

· 隨著治療效果的增加，腫瘤DNA比例大幅減少。

· 正常細胞DNA的汙染。

血檢在非小細胞肺癌的應用

隨著技術的不斷進步，腫瘤血檢已經取得巨大的成功。腫瘤血檢進展最快和最成熟的也是有著最迫切需求的是肺癌靶向療法的伴隨診斷。肺癌病人多，死亡率高，靶向藥物研發進展快。同時肺癌組織取樣困難，危險，容易誘發並發症。肺癌臨床醫生和患者對血檢的需求是最積極的。

肺癌血檢進展最快的是EGFR敏感突變的檢測。EGFR突變在歐美人群占非小細胞肺癌的15%以上，是個比較多的患者人群。在國內比例高達25%以上。FDA去年已經批準了Roche的cobas血檢試劑盒用於一線EGFR突變的酪氨酸激酶小分子伴隨診斷 (2016-6-1)，以及二線三代AZD9291(TAGRISSO)的伴隨診斷 (2016-9-28)。根據已經發表的EGFR T790M陽性患者的數據，組織活檢得到的臨床試驗數據總體應答率(ORR)為62%，無進展生存期(PFS)為9.7個月，血檢的ORR為63%，PFS為9.7月。二者數據非常吻合[2]。血檢與組織活檢一致性也很高。許多其它的公司產品中都包含EGFR的突變檢測。

部分商品化血檢試劑盒彙總

阿斯利康 (AZD) 花費了大量的精力來檢測三代AZD9291的獲得性耐藥突變機製，最新的報告數據顯示約有20%的耐藥突變由C797S突變組成 (100 例患者數據)，即突變了AZD9291的共價結合位點。這個比例比以前的報道要低[3]。期待後續的組織活檢數據報道，可以比較二者的一致性。其它的突變多為零散分布。同時，AZD也在檢測內在 (原發) 突變機製，更多的數據在今年的AACR上應該有更新。

至於用NGS多組合(panel) 檢測，Guardant Health 在推出Guardant 360後，又進一步推出Guardian 500+， 與多個大型製藥公司合作，用於臨床檢測，篩選潛在的腫瘤相關突變基因。這與NCI正在進行的傘式(umbrella)和籃式(basket)臨床試驗的目標是吻合的。即大規模篩選患者人群的可靶向突變，推進，加速靶向藥物的使用和開發進程。當然，組合也不是越大越好，如果入選的突變基因不是驅動致癌突變，或者不可靶向，不能對治療提供診斷意義，意義或許不大，徒增成本。

NGS panel與PCR方法相比，代表了未來更先進的技術。當前，使用者用不同公司的產品得出的結果差異性還很大[4]。AZD的腫瘤轉化部門的VP Carl Barrett 甚至給出了幾種主流產品20%吻合率的值，令人大掉下巴。Barrett提到，正在用商品化的血清和組織樣品來比較不同公司的產品的可靠性，結果可能會在今年AACR年會上公布。看來，相比PCR的方法，NGS在血檢上還需要進一步繼續提高敏感性和一致性。

從輝瑞公布的ALK 融合突變3代ALK抑製劑Lorlatinib的血清cfDNA ALK突變臨床數據，我們能夠得到哪些有用的信息呢?他們用的是BEAMing dPCR 的方法[5]。明顯感到作者對方法的靈活性非常不滿，因為ALK的耐藥突變種類較多，得隨著臨床進展不斷調整PCR引物和反應條件。

從38例患者的血清cfDNA中，檢測到有14例患者有ALK耐藥突變。這個比例與以前報道的組織檢測數據相當。同時，ALK的突變種類，比例分布模式也與以前的報道類似。

血清活檢與以前的組織活檢相比，能夠檢測到更豐富的信號。腫瘤突變的異質性再次得到驗證。以前組織檢查的結果，多數耐藥突變為ALK單一突變，隻有個別是雙突變。但血清檢測到的結果則顯示，有一半的患者的ALK耐藥突變等於或多於2個突變，最多的有4個突變。

Lorlatinib的ALK活性大幅提高，比一代ALK抑製劑Crizotinib的活性提高了20-50倍，臨床前數據表明，它能夠克服幾乎所有的ALK耐藥突變，特別對門控突變L1196M有極高的活性。但令人困惑地是，在所有包含L1196M的六例突變患者中，有三例屬於有效反應，另外三例效果不佳。根據以前的報道，效果不佳的患者，有很大的可能性是由於Src活性增加造成的內在抗藥機製疊加引起的[6]。Src磷酸化活性增加難以用基因檢測的方法觀察到，隻能借助蛋白組學的信息。這也從側麵反映出基因檢測不是萬能的，還要與其它有效的方法借鑒，互補。

Lorlatinib的ALK耐藥突變有一例報道，即L1198F[7]。(血清活檢的結果中還沒有發現同樣的突變)這個新的耐藥突變不能被二代ALK抑製劑克服，卻對一代ALK抑製劑Crizotinib極其敏感，從而形成一個良性循環 (loop) 用藥選擇，把惡性腫瘤轉化成可控製的慢性病。這應該是在發現最終治愈手段之前我們對靶向療法期望中理想的“小目標”了。

血檢在結直腸癌、腸胃癌上的應用

除了肺癌，晚期轉移性結直腸癌(mCRC)是血檢發展較快的。即KRAS突變的檢測。它不是用於KRAS本身的靶向(還沒有有效的直接靶向藥物，藥物化學家加油!)，而是用來指導EGFR抗體用藥 (如cetuximab)，即有RAS野生型的患者對EGFR抗體有效，KRAS突變的患者效果不顯著。德國的Merck在這個方向最積極。與Sysmex合作開發OncoBEAM檢測儀器用於KRAS臨床伴隨檢測，與組織活檢的一致性達到>92%[8]。與Biocartis合作開發傻瓜型診斷一體化儀器(研究用)。隻要把1mL血清加入到檢測儀器中，130 分鍾後自動出結果。號稱10歲的小孩就可以操作。

除了伴隨診斷，KRAS血檢還可以用於藥物治療效果跟蹤，指導用藥，停藥決定。如有報道的病例，EGFR抗體使用造成野生型的RAS發生突變，疾病進展後建議停止使用EGFR抗體，並使用其它治療方法，等KRAS突變檢測呈陰性後，可以繼續使用EGFR抗體。這些方便，靈敏，對患者友好的RAS突變狀態的動態監測，正是血檢的優勢所在，受到醫生患者的積極響應。

雖然KRAS突變在非小細胞肺癌中占的比例高達25%以上，但由於沒有有效的直接靶向KRAS的藥物可以使用，所以KRAS突變信息在肺癌患者中對治療的指導意義當前還很有限，好在腫瘤免疫療法對KRAS突變應答率還不錯。

最近在EORTC-NCI-AACR會議上報道的腸胃癌(GISTs)的一期臨床過程中，完美地應用了液體活檢的手段，跟蹤cKIT和PDGFR的耐藥突變動態變化。Imatinib(Gleevec)在CML有著耐久神藥的稱號，但在在腸胃的靶向突變上，卻很快就產生了耐藥突變。BLU-285和DCC-2618就是設計出來的二代，用來克服一代的耐藥突變。常規血樣液體活檢能夠及時，準確的追蹤臨床藥物的使用效果[9]。看來，以後靶向耐藥臨床試驗的液體活檢有逐漸要成為標準檢測之一的傾向。

血檢cfDNA的其它應用前景

隨著cfDNA技術的不斷進步和成熟，用常規血液cfDNA樣品來大規模篩查罕見驅動致癌突變獲得了很好的機會，比如TRKA， B， C 融合突變在幾乎大多數腫瘤類型中都有表達，但比例都不高[10]。這樣，即使有很好的TRK小分子抑製劑，因為病人招募非常困難，新藥開發進展緩慢。如果常規血檢panel能夠得到推廣，新藥臨床開發可以大大提速。其它的例子象在非小細胞肺癌，c-RET的融合突變有1-2%，c-MET 外顯子14剪切突變在肺癌有2-4%等，都是驅動致癌突變，卻因為病人數量相對較少，嚴重阻礙了小分子藥物臨床開發進展與獲批[11]。

乳腺癌中的PIK3CA 突變，黑素瘤中的BRAF(V600E)也是液體血檢的研究熱點。

用血清cfDNA的手段來檢測基因的過量表達還非常困難。很多時候，cfDNA的表達量與腫瘤組織相應蛋白表達含量不成正比。像乳腺癌的HER2檢測可能還要更多的依賴於傳統組織檢測手段。

至於許多其他的腫瘤類型，特別是致癌突變基因不明確，靶向藥物缺乏的情況下，血檢的重要性和迫切性還不是很明顯。

隨著腫瘤免疫療法臨床數據的不斷積累，大規模的NGS血檢數據也許可以輔助預判免疫反應的概率，用來指導潛在的用藥組合。這應該是較為遙遠的目標。

最後，最具社會價值的應用之一是癌症特別是肺癌的早期診斷了。肺癌總體5年生存率隻有18%。如果能夠早期發現，一期的五年生存率高達45-49%，二期也有30%。三期14%，四期隻有1% (美國癌症協會網站統計，2000年的少有的早期數據，現在肺癌晚期生存率應該提高了很多，見[11])。由於肺癌屬於看不見，摸不著的腫瘤類型，同時早期發病時症狀也不明顯，導致多數患者確診時已是晚期。腫瘤液體血檢早期診斷還處在起步階段，也是Grail要努力的方向。當然，潑冷水的也大有人在，批評他們好高騖遠，搞高大上全， 不如來點實在的[1]。我覺得這是一個有前景的方向，特別值得慈善基金投資。