過去20年來,單分子成像與操縱領域的進展迅速，孕育出了一門基於觀測單個分子來理解生物過程的新學科――單分子生物學。在全世界許多實驗室的推動下，這個嶄新的領域改變了我們對於許多生物學問題的思考與理解，並產生出很多新知識。

一個早期單分子生物學的例子是我們對膽固醇氧化酶催化的研究。此酶含有的核黃素輔基在氧化態下是天然的熒光基團，而在還原態下則不發光。每一次熒光的“亮/滅”循環對應一個酶分子催化狀態的翻轉，從而使得對單個酶分子反應的實時觀察成為可能。在單分子層麵上，化學反應是隨機發生的(即化學反應發生所需的等待時間是隨機分布的)，而不像在擁有大量分子係統中的反應那樣有可被推測的結果。由於很多生物大分子(例如DNA)是以單分子或者少量幾個分子的形式存在於細胞之中，能對單分子化學反應進行實時觀察就尤為重要。

單分子酶學也具有實際應用意義。例如，單分子測序儀通過監測單個DNA聚合酶分子將有熒光標記的核苷酸逐個合成到一個單鏈DNA模板上的過程，以直接讀取DNA分子的序列。盡管單分子測序儀在成本、準確性和通量方麵還不能與基於大量分子的DNA測序儀相競爭，但它的一個獨特的優勢是能夠測很長的DNA序列。2007年以來基於大量分子(而不是單分子)的“新一代”DNA測序儀的出現，已開啟了激動人心的個體化醫療的新紀元。

然而在基礎研究領域，單分子生物學不僅在體外而且在活細胞內均增進了我們對許多大分子係統工作機理的深入理解。一個基因在單個細胞中隻有一個或者兩個拷貝，基因表達的過程和單個酶分子反應一樣，也是隨機發生的。因此，單分子生物學與單細胞生物學是密切相關的。近年來，我們對單個活細胞中mRNA和蛋白質分子逐個產生的隨機過程進行了詳細的研究，從而使得分子生物學的“中心法則”在單分子層麵上得到了定量的描述。

DNA以單分子(單個染色體)的形式存在於每一個人體細胞中，所以基因組的變化也是隨機發生的。相應的，人類生殖細胞分裂時發生的隨機重組使得每一個細胞都不相同，而癌細胞中劇烈的基因組變化也使得原發腫瘤中的細胞之間存在高度的異質性。在一個細胞中最常見的基因組改變包括單核苷酸變異[SNV，一種單堿基對的點突變;基因拷貝數變異(CNV)]。在人類整個基因組的六十億個堿基對中的一個特定的SNV就可能導致遺傳性疾病;而CNV通常發生在生殖細胞分裂時的染色體分離過程中以及腫瘤細胞內基因組的重排錯誤(包括插入、缺失、染色體倒位和易位)。由於SNV和CNV在不同細胞中的發生是隨機的、不同步的，因此每個細胞都擁有不同的基因組，這使得單細胞測序成為必需。而直到最近，由於單細胞基因組學的發展，這種必需才變得可行。

給單個人類細胞做全基因組測序需要對其進行全基因組擴增(WGA)。新近發展的一種WGA方法――多重退火循環擴增法(MALBAC)5，可以比此前廣泛應用的MDA方法更準確地檢測SNV和CNV。MALBAC可以在人體細胞中數字化地計數一個基因的拷貝數,並且能夠沒有假陽性地檢測單個SNV(雖然可能會有一定的假陰性)。

最近，我們把MALBAC用於協助人工輔助生殖和癌症的研究，兩者皆對精準醫學有著重要意義。在人工輔助生殖領域，為了避免染色體異常和單基因疾病的遺傳，MALBAC已經被應用於胚胎植入前基因組篩查(PGS)和胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)。染色體異常(即染色體層麵上的拷貝數變異)是流產及許多遺傳性疾病(如唐氏綜合征)的主要致因。同樣，約7000種單基因遺傳疾病會嚴重影響人類健康，並對病人家庭和社會醫療體係產生沉重負擔。

雖然PCR、熒光原位雜交(FISH)和DNA微陣列芯片等方法都已經被用於PGD和PGS，MALBAC能夠提供更高的精確度，並可以同時避免染色體異常和危險點突變的發生。2014年，隨著兩個“MALBAC嬰兒”的出生,我們成功地利用了MALBAC來篩選健康胚胎，使嬰兒基因組中避免帶有父母中一方所攜帶的遺傳疾病基因。這為患有遺傳性疾病(或攜帶遺傳疾病基因)的夫妻帶來了福音，他們現在可以以很高的成功率避免將那些具有嚴重危險的突變傳給下一代。

在這兩個病例中,MALBAC極低的假陽性和假陰性率完美地滿足了父母希望後代不再攜帶嚴重的雜合致病突變的要求。類似的方法可以減少某些疾病(如乳腺癌)在下一代中的遺傳風險。選擇一個風險較低的等位基因(如特定的BRCA基因序列)在技術上是可行的，但在倫理層麵上還需進一步討論。

眾所周知，癌症是一種基因組疾病。循環腫瘤細胞(CTC)在進入外周血液循環後可能介導癌細胞的轉移，並導致90%與癌症相關的死亡。MALBAC方法也被用於單個CTC細胞測序。與癌症高度異質性的點突變不同，通過分析肺癌患者的單個CTC基因組，我們發現CTC的CNV模式在一個病人體內以及在患同一種癌症的不同病人中是相似的，但在不同的癌症類型中是截然不同的。此外，這些CTC中重複出現的CNV模式與患者的轉移灶腫瘤細胞CNV模式也是一致的。顯然,染色體特定區域拷貝數的增減模式被腫瘤轉移所選擇。循環腫瘤細胞的CNV模式與癌症類型有關這一發現為我們提供了基於CNV模式進行無創癌症診斷的可能。因此，單細胞全基因組擴增方法的進一步發展將使我們不僅能夠更好地了解腫瘤異質性和癌症轉移的機製，而且有望實現對癌症的個體化診療。

總結

DNA以單分子的形式存在於每個細胞中，因此基因表達和基因組的變化是隨機發生的，這也使得在單細胞和單分子水平上的測量成為必需。單細胞基因組學發端於單分子技術與基因組學的交彙之處。在單細胞中進行精確基因拷貝數的計數以及基因點突變的檢測現在不僅已成為可能，而且正在成為日益重要的技術。這些手段使得我們能夠在單個分子的層麵上檢測、理解並改善生命過程，也為我們提供了“精準醫學”的生動案例。

[JAMA2015;313(20):2021-2022]